Способ определения степени деструкции клеток Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

00

о

30

Изобретение относится к криобиоло гии, в частности к способам определе ния степени деструкции клеток ткани. Известен способ определения де струкции клеток злокачественнЕлх опу- холей в организме человека, который состоит в qпpeдeлeнии количества кле ток в моче человекаf разрушенных этерификацией высшими жирными кисло, тами при рН 4,2 - 5,8 и 80 - i Однако способ применим только к злокачественным клеткам и не позволя ет непосредственно наблнздать повреждения клеток в процессе экстремальны воздействий« Известен также способ определения степени деструкции клеток ткани и клеточных суспензий, включающий полу чение исследуемого материала и воэдействие на клеточные суспензии экстремального фактора с последующей регистрацией физико-химических изменений в реакционной смеси 2. Однако способ применим только для :эритроцитов, исключает возможность непосредственного наблюдения повреждения, а также определяет только грубые нарушения мембраны клеток (диаметр молекулы гемоглобина больше 80 fy) , является длительным (40 60 мин), Целью изобретения является повыгив ние точности и ускорения способа. Поставленная цель достигается тем что согласнсЗ способу определения сте пени деструкции клеток, включакяцему получение исследуемого материала и (Воздействие на клеточные суспензии экстремального фактора, к клеточным суспензиям добавляют 10 - 210% раствора 2,2,6,б-тeтpaмeтил-4-oкcoпипepидин- -oкcилa иО,5-2,ОМ раствор хлористого никеля и по величине сигнала злектропарамагкитного . резонанса определяют степень деструк ции клеток. Способ осуществляют следующим образом. В исследуемую взвесь клеток вводят водный раствор, который содержит стабильный иминоксильный радикал с концентрацией IO -2IO M, проникающий в цитозоль клеток и дающий сигнал электропарамагнитного резонанса (ЭПР), регистрируемый на радиоспект рометре. Затем добавляют парамагнитную соль концентрации 0,5 - 2 М (в норме не проникакнцую через мембрану) , что приводит вследствие обменных взаимодействий к уширению (исчезновению) сигнала ЭПР от радикала, находящегося во внеклеточной жидкоети, в результате чего наблюдается сигнал исключительно от радикалов в цитозоле нарушение целостности мемб рана клеток приводит к проникновению парамагнитных ионов в цитозоль и к полному или частичному исчаэноБению си1нала ЭПР. При этом уменьшение сигнала ЭПР пропорционально количеству разрушенных клеток ткани или клеточной суспензии. В стеклянную ампулу вводят 0,1 1,0 мл водного раствора иминоксйльного радикала концентрации 2 «10 М, 0,1 - 1,0 мл парамагнитной соли концентрацией 0,5 - 2,0 М и. 0,88,0 мл взвеси клеток, в результате чего наблюдают сигнал ЭПР от радикалов , проникших в нитозоль-клеток. Затем исследуемую взвесь подвергают температурному, химическому, радиоактивному или другим воздействиям. Если в результате происходит повреждение мембраны клеток, регистрируемый спектр имеет меньшую или нулевую интенсивность, в зависимости от числа поврежденных клеток. Отношение h(j2 к Ьо;(Дает процент неповрежденных клеток. Пример. В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала 2,2,6,б-тетраметил-4-оксопиперидин-1-о.ксил с концентрацией 10 М 0,1 мл водного раствора парамагнитной соли NiClg и 0,8 мл взвеси эритроцитов. Охлаждение взвеси клеток до температуры 3°С с кристаллизацией суспензии и последующий отогрев ее приводит к уменьшению исходного сигнала ЭПР за счет разрушения части клеток. Относительная величина неповрежденных в результате кристаллизации и отогрева клеток составляет 56%. Пример2, В стеклянную ампулу вводят ,l мл водного раствора радикала 2,2,6,б-тетраметил-4-оксо- пиперидин-1-оксил с концентрацией и кусочек ткани кожи человека весом 100 мг, Затем осуществляют инкубацию при комнатной температуре в ;течение 30 мин. После этого добавляют 0,1 мл раствора соли NiClgконцентрацией 0,05 М и наблюдают сигнал от радикала в цитрзоле клеток ткани кожи. .Медленное .замораживание образца со скоростью 3 .град/мин-, до.-. 196°С и-медленное оттаивание до комнатной температуры приаодит к падению интенсивности исходного сигнала на 15%, что свидетельствует о разрушении 15% клеток, Примерз. В стеклянную пулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала с концентра™ цией 0,1 мл водного раствора парамагнитной солл NIC 12 с концентрацией 0,5 М и 0,8 мл взвеси эритроцитов. Наблюдают спектр ЭПР .от ргщккалов в цитозоле эритроцитов. Далее медленно нагревают взвесь со скоростью 2 - 3 град/мин. Выше температуры +56,С происходит резкое исчезновение сигнала ЭПР вследствие разрушения клеток эритроцитов. П р и м е р 4, В стеклянную ампулу вводят 0,1 мл водного раствора иминоксильного радикала с концентрацией 0,1 мл раствора соли NiCl (0,5 Н) и 0,8 мл взвеси эритроцитов Наблюдают спектр ЭПР от радикалов в цитоплазме эритроцитов. Затем добавляют 0,1 мл раствора прижина так, что конечная концентрация его около 3%. Взвесь инкубируют при в течение 40 мин. Берут пробы через каята 10 мин. Сигнал ЭДР с течением времени постепенно падает и через 40 мин его интенсивность составляет 40% от исходной, т.е. остается 40% целых клеток. Таким образом, наблюдают кинетику разрушения эритроцитов с помощью протеолитического фермента прижина, который расцепляет пентидные связи поверхностных мембранных белков эритроцитов. Примерз. В стеклянную ампу:лу вводят 0,1 мл раствора.цминоксильного радикала концентрацией 0,1 мл раствора соли KiCl4(0,5 М) и 0,8 мл взвеси эритроцитов. Наблюдают спект ЭПР от зондов в цитоплазме. Затем добавляют раствор химичес кого детергента тритона Х«100 в концентрации 0,1%. Время инкубации при комнатной температуре 5 мин. Регистрация спектров после этого показывает полное исчезновение сигнала дПР вследствие проникновения ионов N1 в клетки из-за разрушения клеток. I Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет добиться высокой точности определения за счет оценки количества неповрежденных клеток во время воздействия экстремаль фактора, а также сократить время определения до 3 - 5 мин.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ДЕСТРУКЦИИ КЛЕТОК, включакяций получение исследуемого материала и воздействие на клеточною суспензии экстремального фактора с последующей регистрацией Физико-химических идме- . нений в реакционной смеси, отличающийся тем, что, с целью повьоиения точности и ускорения спо соба, к клеточньм суспензиям добавляют М раствор 2,2,6,6-тетраметнл-4-оксопипериДин-1-оксйла и 0,5-2,0 М раствор хлористого никеля и по велич :не сигнала электропарамагнитного резонанса определяют степень деструкции клеток.