Способ определения поврежденияКлЕТОК ульТРАфиОлЕТОВыМ излучЕНиЕМ Советский патент 1981 года по МПК G01N1/38 G01J3/00 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОК УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ИЗЛУЧЕНИЕ/П

1

Изобретение относится к медицине, а именно цитологии.

Известен способ определения повреждения клеток ультрафиолетовым излучением путем окрашивания их с последующей спектрофотометрией 1,

Однако данный способ не позволяет выявить повреждения клеток на ранних стадиях.

Цель изобретения - выявление ранних стадий повреждения клеток.

Поставленная цель достигается путем окрашивания клеток с последующей спектрофотометрией, при этом клетки окрашивают 0,01-0,015%-ным раствором альцианового синего и по содержанию красителя, сорби.рованного на клеточной мембране, определяют стадию повреждения клеток.

Пример Г. Клетки асцитной гепатомы Зайделя получают от беспородных крыс весом 120-150 г. Животных забивают, выделяют асцит, наслаивают его на физиологический раствор 0,9% NaCl при рН 7,4. Содержащиеся в растворе клетки 2-3 раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80-lOOg. После отмывки клетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацию до 10 кл/мл.

К 1 суспензии клеток, содержащей 10® кл/мл, прибавляют 2 мл 0,015/о-ного альцианового синего (АС). Конечная концентрация красителя составляет 0,01%. Смесь инкубируют 30 мин, затем клетки осаждают центрифугированием при 27000 g в течение 15 мин при 4°С. Надосадочную Жидкость, представляющую собой раствор красителя, спектрофотометрируют в диапазоне 480-830 мм, концентрацию раствора АС после окрашивания им клеток определяют по величине максимального поглощения красителя при Л 617 нм. После этого осадок окрашенных клеток промывают в 1 мл физиологического раствора (для удаления слабосвязанного с клетками альцианового синего) и еще. раз центрифугируют при 27000 а 15 мин при 4°С. Надосадочную жидкость спектрофотометрируют в диапазоне 480-830 нм и по величине максимального поглощения красителя нм определяют концентрацию остаточного и слабосвязанного красителя. Затем расчитывают коэффициент распределения слабосвязанного красителя между клеткой и средой по формуле Q - коэффициент распределения слабосвязанного красителя; Cj- концентрация раствора АС после окрашивания им клеток ед. оптич. плотности; концентрация слабосвязанного освобождающегося при промывке клеток) красителя, ед. оптич. плотности; Уемя-объем клеточнбй суспензии, мл; fl - количество в ней клеток; V4ffrt объем внешнего примембранного слоя одной клетки, 1Чл, который вычисляли по формуле: впнс. влисЬ, площадь внешних примемёран , -. j. , , .- . НЫХ слоев (ВПМС), равная ПЛО щади поверхности клетки || - толщина ВПМС, равная 1 мкм. Отмытый осадок клеток вручную гомогенизируют в 3 мл 2%-ного водного раствора додецилсульфата натрия, в котором клетки частично растворяются, а частично диспергируютёя. Полученный препарат спектрофотометрируют в диапазоне 480-830 нм, концентрацию экстрагированного красителя определяют в максимуме поглощения красителя при-617 нм с поправкой на светорассеяние суспензии. Коэффициент распределения красителя между поверхностью клеток и средой рассчитывают по формуле: Л - Ос . Uyc/l s 14ш,.-я. 7 где Q - коэффициент распределения; Сс - концентрация экстрагированного красителя, ед. оптич. плотности; Cg-концентрация красителя в физиологическом растворе после окрашивания им клеток, ед. оптич. плотности. П р и м е р 2. Клетки асцитной гепатомы Зайделя получают от беспородных крыс весом 120-150 г. Животных забивают, выделяют асцит, наслаивают его на физиологический раствор 0,9% NaCI при рН 7,4. Содержащиеся В растворе клетки раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80-lOOg. Порле отмывки клетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацияю до 10 кл/мл Дальнейшие операции производят аналогично изложенному в при-мере 1. Пример 3. Клетки асцитной гепатомы Зайделя получают от беспородных крыс весом 120-150 г. Животных забивают, выделяют асцит, наслаивают его на физиологический раствор 0,9% NaCl при рН 7,4 и клетки 2-3 раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80-lOOg. После отмывки йлетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацию до 10® кл/мл. К 1 мл суспензии клеток, содержащей 10 кл/мл, прибавляют 2 мл 0,015%-ного альцианового синего. Конечная концентрация красителя составляет 0,01%. Смесь инкубируют 30 мин, затем клетки осаждают центрифугированием при 27000 g в течение 15 мин при 4°С. Надосадочную жидкость, представляющую собой раствор красителя, спектрофотометрируют в диапазоне 480- 830 нм, концентрацию раствора альци анового синего после окрашивания им клеток определяют по величине максимального поглощения красителя приЛ . 617 нм и сравнивают с результатами спектрофотометрирования клеток, концентрация которогсГ всегда постоянна (0,01%). Мерой сорбции краси..viiiiiM Iv jVi I J I .IJlV k V ri J LJ J I H еля клетками служит коэффициент распределения красителя между их поверхностью и средой, .который расчитывают по формуле П - Cc-Cf .УУСЦ- с Venae-ft Q - коэффициент распределения (величина безразмерная); Со- концентрация исходного раствора альцианового синего, ед. оптич. плотности; С -концентрация раствора после окрашивания им клеток, ед. оптич. плотности; V jw -объем клеточной суспензии, мл; П - количество в ней клеток; Дд -объем внешнего примембранного слоя одной клетки, мл, который вычисляли по формуле: VMWC Sewre-h, ВПМС.- площадь внещних примембранных слоев (ВПМС), равная площади поверхности клетки; Л- - толщина ВПМС, равная 1 мкм. Пример 4. Клетки осцитной гепатомы Зайделя получают от беспородных крыс весом 120-150 Р, животных забивают, выделяют асцит, наслаивают его на физиологический раствор 0,9% NaCl при рН 7,4 и клетки раза отмывают от асцитической жидкости, центрифугируя при 80-100 g. После ОТМЫВКИ клетки ресуспензируют в физиологическом растворе, доводя концентрацию до 10 КЛ//МЛ. Дальнейшие операции производят аналогично изложенному в, примере 3. В таблице приведены сравнительные результаты коэффициента распределения красителя между клеточной поверхностью клеток и средой при разных степенях повреждения клеток и при разных концентрациях окрашиваемых клеточных суспензий. Как видно из таблицы, наибольшие значения коэффициента распределения красителя между поверхностью клеток и средой и,, следовательно, наибольшая сорбция альцианового синего поверхностью клеток были установлены для неповрежденных (контрольных) клеток. У клеток, облученных коротковолновыми и длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами в летальной дозе, снижающей опухолеобразующую способность клеток на 37%, значения коэффициента умень,шаются до 60-72% от значений коэффициента у неповрежденных клеток при окрашивании суспензии с концентрацией 10 кл/мл и до 72-84/о при окрашивании суспензии с концентрацией 10 кл/мл. При облучении клеток обоими видами ультрафиолета в дозе, снижаюшей их опухолеобразуюшую способность на 99%, значения коэффициента уменьшаются до 35-40% и 47-51% при окрашивании суспензий в концентрациях 10 и 10 кл/мл соответственно. Наименьшие значения коэффициента установлены для погибающих клеток, которые были необратимо повреждены воздействием высокой дозы коротковолновых ультрафиолетовых лучей, теплом или продолжительной инкубацией с трипсином.

О

Контроль430 59

альная доW37%

КУФ

е«

ДУФ 258 ±123

альная до172±11799%

КУФ ЛУФ

Немедленная гиКоэффициент распределения красителя между поверхностью клеток и средой. Коротковолновое ультрафиолетовое излучение.

Длинноволновое ультрафиолетовое излучение.

lOO

790+19О

66Oil69

84 72 570 illO

368 ±147

47 51 Значения коэффициента распределения у погибающих клеток в случае окрашивания суспензий в концентрации 10 и 10 кл/мл составляют 10-30% и 11-39% от контроля соответственно. Следовательно, наиболее сильное снижение сорбции альцианового синего происходит у погибающих клеток. предлагаемый способ позволяет регистрировать по величине сорбции альцианового синего клеточной поверхностью степень (глубину) повреждения клетки, вызванного воз- действием различных по своей природе агентов, причем такая регистрация возможна сразу по окончании воздействия повреждающего агента. Способ позволяет значительно углубить представления о механизме повреждения клеток при действии ультрафиолетового излучения и показать участие деструктивных изменений клеточной поверхности в лучевом повреждении клеток. Кроме того, способ создает определенные предпосылки для расшифровки цитологического механизма повреждения клеток различным по своей физикохимической природе агентами, а не только ультрафиолетовым излучением, он позволяет диагностировать состояние поверхностных структур опухолевых клеток, которые в свою очередь обуславливают их способность к злокачественному росту. 78

Формула изобретениясителя, сорбированного на клеточной мемСпособ определения повреждения клетокток. ультрафиолетовым излучением путем окрашивания их с последующей спектрофотомет-Источники информации, рией, отличающийся тем, что, с целью выяв-5 принятые во внимание при экспертизе ления ранних стадий повреждения, клетки1. Третьяков А. В. Изучение действия окрашивают 0,01-0,015°/о-ным растворомпистонов на опухолевые клетки. -«Цитолоальцианового синего и по содержанию кра-гйя, 1974, т. 16, № 4, с. 481-485.

834435 бране, определяют стадию повреждения кле