Штамм бактерий SеRRатIа маRсеSсеNS, используемый для трансформации ДНК с геном устойчивости к ампициллину Советский патент 1990 года по МПК C12N1/20 C12N9/14 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, представляет собой новый штамм бактерий Serratia marcescens, неспособный продуцировать внеклеточную-эндонук- леазу (К.Ф.3.1.4.9), чувствительный к ампициллину, и может быть использован в генетических исследованиях и получении штаммов - продуцентов биологически активных веществ.

Цель изобретения - получение штамма Serratia marcescens ВКПМ В-3858 (33), отличающегося отсутствием способности продуцировать эндонукле- азу и чувствительного к ампициллину.

Штамм предлагается использовать как реципиент для введения в него

методом трансформации рекомбинантных молекул, несущих гены биологически активных веществ и устойчивости к ампициллину и создания таким образом на его основе штаммов - суперпродуцентов .

Создание штяммов - продуцентов биологически активных веществ пое- дусматривает введение в клетки бактерий, посредством трансфо| ации рекомбинантных молекул ДНК, несущих наряду с геном биологически активного вещества ген устойчивости к какому-либо антибиотику. Последующий отбор клеток, содержащих реком- бинантные молекулы ДНК, ведется по устойчивости к этому антибиотику.

;л

эо :л

ifs

ю

ч

Высокая нуклеазная активность клеток S, тагсевсепв затрудняет введение в них рекомбинантной ДНК, с по трансформации; Высокая устой- чивость гатаммов S. marcescens к . большому числу антибиотиков, в том числе к ампициллину, затрудняет отбор клонов, несущих рекомбинантные молекулы, и делает невозможным ис- пользование большинства векторов,, несущих ген устойчивости к ампициллину.:

Штамм получен методом индуцированного мутагенеза при облучении музейного штамма Serratia marcescen Ви 211 АТСС9986 ультрафиолетовым светом с последующим отбором колоний, не обладающих эндонуклеазной активностью. На следующем этапе культуру, полученную из колонии, не обладающей зндонуклеазной-активностью, о брабатывали Ы-метил-М-нит- розо-К-нитрогуанидином с последующим отбором колоний, чувствительных к ампициллину.

Штамм S, marcescens № 33 имеет следующие свойства.

Морфология, Клетки палочковидные размером 0,6-0,,0 мкм, одиночные парные или соединенные в цепочку, грамотрицательные, подвижные.

Культуральные и физиологические свойства. На МПА .через 24 ч роста блестящие гладкие колонии ярко-крас ного цвета, выпуклые, с ровным кра- ем, диаметром 1,5-2,0 мм. На картофеле - блестящий красный налет. Молоко свертьтает, но не пептонизи- .рует, желатин разжижает,

Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, сахарозу, мальтозу, сорбит, инозит, маннит, салицилат. Не ферментиру т лактрз у, адонит, дульцит ксилозу, ара-бинозу, рамнозу. Не рас- щепляет мочевину. Сероводород, индол не образует. Реакция Фогес-Прос кауэра положительная, реакция с метил-рот - отрицательная, Оптимал)ьная температура роста 28-30 С, рН среды 7,4-7,6,

Эндонзгклеазная активность. Не образует зоны деполимеризации ДНК вокруг колоний в процессе роста на индикаторной аг аризованной среде в течение 24 ч, Эндонуклеазная активность не обнаруживается в культу- ральной жидкости штамма (определение по продуктам гидролиза ДНК) при

с

5 0 5

Q

с Q

5

0

5

выращивании в течение 36 ч на качалке (180-300 об, на модифиииоо- ванной среде Бантинг, Следовая Эндонуклеазная .активность (Г,О- 4,0 виск, ед, мл.- в культуральной жидкости и 0,5-1,0 виск, ед, мг- белка в кл1еточных лизатах) обнаруживается вискозиметрическим Методом,

Чувствительность к ампициллину. Штамм не растет на мясопептонном агаре при концентрации ампициллина 25 мкг на I мл среды.

Пример 1, Получение штамма, неспособного Продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствительного к ампициллину.

Исходный штамм Ви-2П АТСС 99в6 выращивают на мясопептонном агаре в течение 18 ч при 2810,, Выросшие клетки смьшают 0,5%-ным физиологическим раствором, осаждают центрифугированием и ресуспензируют в О,1 MNa-фосфатном буфере до величины оптической плотиости 0,12-0,15 при 650 нм. Полученную суспензию клеток облучают бактерицидной ультрафиолетовой лампой Буф-2 на расстоянии 60 см в течение 100 с..К облученной суспензии добавляют мяЬопеп- тонный бульон (1/3 объема суспензии) и инкубируют в темноте в течение 3 ч при 28 С, После инкубирования клетки высевают в чашки Петри с мя- сопептонным агаром, в который был добавлен индикатор (для выявления продуцентов эндонуклеазы), содержащий 0,6 мг/мл дезоксирибонуклеино- вой кислоты (ДНК)и 0,01% толуидиново- го голубого, окрашивающий среду с ДНК в голубой цвет, BOKPJT колоний, вьделяющих эндонуклеазу через 24 ч роста, в результате гидролиза ДНК образовьшался ореол розового цвета. Отбирают колонии, не образующие зоны гидролиза ДНК на среде с толуи- диновым синим. Все отобранные варианты проверяли на эндонуклеазную активность, В результате был отобран мутант, неспособный продуцировать неспецифическую внеклеточную зндонуклеазу..

Полученный мутанг засевают в колбы с мясопептонНым бульоном до оптической плотности 0,05 при 650 нм, Культуру выращивают на качалке до оптической плотности 0,5, осаждают клетки центрифугированием, промывают 0,1 М цитратным буфером, рН 5,5,

Затем клетки суспендируют в том же буфере до оптической плотности 0,4,

добавляют Ы-метил-Н-нитрозо-Ы -нит- рогуанидин (Koch-Lidht) до концентрации 75 мкг/мл, инкубируют 30 мин при 37 С. После инкубации клетки осаждают центрифугированием, промывают 0,1 М фосфатньм буфером, рН 7,0 и рассевают в чашки Петри с мясопеп- тонньм агаром. Выросшие колонии проверяют на способность к росту на мясопептоннбм агаре с ампициллином (25 мкг/мл) и на эндонуклеазную активность. В результате отобран мутант № 33, неспособный продуцировать неспецифическую внеклеточную нукле- азу и чувствительный к ампициллину,

Пример 2, Изучение эндо- ;нуклеазной активности. Исходный штам Ви 211 АТСС 9986 и штамм № 33 выращивают в течение 1 сут в пробирке со скошенным мясопептонным агаром, смьшают 0,5%-ньм физиологическим раствором и засевают (из расчета 1 мл инокулята на 100 мл среды) в колбу объемом 1 л со 100 мл среды. Бактерии выращивают на среде, содержащей, . г/ л: глицерин 5,0; цитрат аммония 5,0; двузамещенный фосфат калия 10,0; сернокислый магний 0,5; хлористый натрий 0,5; сернокислое железо 0,05; гидролизат казеина 1,0; дрожжевой экстракт 3,0, рН среды 7,6, Выращивание ведут на качалке (180-200 об. мин) при оптимальной температуре 28tO,5 c в течение 36 ч , Затем бактериальные клетки отделяют центрифугированием при 6000g 20 мин. Клеточные лизаты получают 1I-кратньм замораживанием бактериальных клеток с последующим оттаиванием, В надоса- дочной жидкости и клеточном лизате определяли эндонуклеазную активность вискозиметрически и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в 2%-ной НС 10 4, Реакционная смесь объемом 1,0 мл содержала 1 мг ДНК; 0,07 М трис-буфера, рН 8,5; 0,007 М MgSOjj, 0,1 мл культуральной жидкости, освобожденной от микробных клеток. Реакционную смесь инкубировали 15-20 мин при , реакцию останавливали добавлением 4%-ного раствора охлажденной НС10 в объеме, равном объему реакционной смеси. Осадок удаляли центрифугированием на холоду при 6000g X 20-30 мин, В над- -осадочной жидкости после разведения

0

5

5

0

в 20 раз измеряли оптическое поглоще ние при 260 нм на спектрофотометре СФ-16, За единицу активности прини- g мали количество фермента, которое дает увеличение оптической плотности в опытных образцах, по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента) на одну оптическую единицу за 1 ч инкубации в пересчете на 1 мл культуральной жидкости (опт, ед, , В качестве субстрата использовали, препараты высокомолекулярной ДНК, вьщеленной из тимуса теленка по методу Кея в модификации Бенинга или коммерческие препараты высокомолекулярной ДНК,

Результаты определения внеклеточной эндонуклеазной активности исходного и предлагаемого штамма пред- стаьлены в табл, 1,

Как видно из данных табл, 1, не обнаруживается эндонуклеазная ак- . тивность в культуральной жидкости и клеточных лизатах предлагаемого штамма № 33 по образованию кислото- рас.творимых продуктов расщепления ДНК, Обнаруживается следовая эндонуклеазная активность,, равная 1,0- 4,0 виск.ед, мл- и 0,5-1,0 виск, ед, белка, в культуральной жидкости и клеточных лизатах штамма соответственно вискозиметрическим методом,

Эндонуклеазная активность в культуральной жидкости исходного штамма АТСС 9986 на 36 ч выращивания равна 4000,0-6000,0 виск, ед, мл,

0

5

5

960,0-1500,0-оптич, ед, или 0 1,6-2,5 мкМ расщепленной ДНК на 1 мл в 1 мин, В бесклеточных лизатах исходного штамма также обнаруживается высокий уровень эндонуклеазной активности, равный 90,0-100,О виск, ед, 35,0-40,0 оптич, ед,, 0,05-0,07 мкМ в расчете на 1 мг белка.

Пример 3, Трансформация клеток мутантного штамма № 33 (не обладающего нуклеазной активностью чувствительного к ампициллину /nuc , ДНК плазмиды pUC 19, несущий ген устойчивости к ампициллину.

Ночную культуру штаммов S, marces- cens 33 и 9986 засевают в МПБ и выращивают при интенсивной, аэрации до оптической плотности 0,10-0,15 при Д 650 нм (1 -10 - 2-10« кл/мл), Выросшие клетки осаждают на холоду

0

5

в течение А мин при 4000g и отмьюа- ют от питательной среды холодным раствором, содержащим.1 О мМ трис-НС1 (рН 8,0).

Отмытые клетки вновь осаждают при тех же условиях. Осадок ресуспенди- руют в половине начального объема охлажденного во льду раствора, содержащего 30 мМ CaCl, 10 мМ трис-НС1 (рН 8,0) и выдержотают в течение 15 мин во льду. Клетки вновь осаждают и ресуспендируют в 1/15 начального объема выше указанного раствора. Затем суспензию оставляют на 20 ч при , после чего к ней добавля-; ют раствор плазмидной ДНК pUC 19 в количестве 1 мкг и выдерживают при в течение 30 мин. Затем пробы переносят в водяную баню, нагретую до , и вьвдерживают в течение 2 мин. После инкубации проб при 42°С к ним добавляют по 1 мл МПБ и ставят в термостат на на 1 ч. Затем клетки высевают на МПА, в который

в качестве селек тирующего агенту,Добавлен ампициллин в концентрации 200 мкг/мл. Посевы инкубируют при в течение 48 ч, после чего под- считьшают количество устойчивых к ампициллину клеток. Наличие в клетках плазмидной ДНК определяли методом щелочного лизиса с последующим электрофорезом в агарозном геле.

Результаты эксперимента представлены в табл, 2,

Как видно из данных табл, 2, использование для трансформации клеток исходного штамма, обладающего нуклеазной активностью и устойчивостью к ампициллину, делает невозможным отбор трансформированных клеток и вьщеление из них плазмидной ДНК.

Формула изобретения

Штамм бактерий Serratia marcescens ВКПМ В-3858, используемый для трансформации ДНК с геном устойчивости к амп ициллину,

Таблица 1

Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой новый штамм бактерий SERRATIA MARCESCENS ВКПМ В-3858 (N33), неспособный продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствительный к ампициллину. Штамм может быть использован в генетических исследованиях и получении штаммов-продуцентов биологически активных веществ. Цель изобретения - получение штамма SERRATIA MARCESCENS ВКПМ В-3858/33/, отличающегося отсуствием способности продуцировать внеклеточную эндонуклеазу, чувствительного к ампициллину. Использование предлагаемого штамма делает невозможным отбор трансформированных клеток и выделение из них плазмидной ДНК. 2 табл.

Таблица 2