1
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при идентификации иммуногистохимических срезов органов и тканей человека и типировапии опухолей эндотелиального происхождения.
Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мьши Mus musculus, используемого для получения моноклональных антител к поверхности эндотелиальнык клеток пупочной вены человека.
Штамм получают следующим образом. Мышей линии BALB/C иммунизируют л введением 1 млн. культивируемых эндо телиальных клеток пупочной вены человека в 1-5 пассажей. Клетки вьфащива ют на пластике, покрытом желатином, в среде 199 на солях Эрла с добавлением 20% человеческой сыворотки. Непосредственно перед иммунизацией клетки снимают с подложки механическим путем, отмывают от сывороточных белков средой 199, суспендируют в 0,5 МП той же среды и вводят в мьшь внутрибрюшинно. Через 10 и 20 дней после первого введения проводят до- полнительные иммунизации аналогичным образом. Через 3 дня после последней иммунизации иммунных мышей забивают, 15x1 о клеток селезенки гибридизуют с 5x10 клеток миеломы мыши P3/Ag. 8.653 в течение 1 мин в присутствии 0,7 МП раствора, содержащего 45 об.% полизтиленгликоля (ПЭГ) мол. массы 4000 и 15% диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки клеток средой 199 от .ПЭГ клетки высевают в 96-лу- ночные панели по 1x10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду ДМЕМ с добавлением 20% эмбриональной коровьей сыворотки, 100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина и 16 мМ тими- дина.
Гибриды отбирают по способности продуцировать антитела к поверхности культивируемых эндотелиальных клеток Отобранные гибриды двалоды клонируют методом конечных разведений. После повторного клонирования практически 100% субклонов продуцируют антитела к эндотелию. Продукция антител сохраняется по крайней мере до 20-го пассажа.
Продуктивные субклоны выводят в массовую культуру и обозначают НЕ25 Штамм НЕ25 хранится в Специализиро
f
0
ванной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных под номером 33D и характеризуется cлeдyюIци rи признаками.
Культуральные признаки.
Культивирование г ибридных клеток НЕ25 проводят в пластиковых флаконах в среде RPMI 1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл пенилициллина и стрептомицина, 0,05 мМ 2-меркаптоэта- нола и 0,15% гидрокарбоната натрия в атмосфере 5% углекислого газа при 37 С Посевная доза 10 - 100 тыс.
клеток в мл, плотность в монослое g 1x10 клеток на кв. см. Культуру пассируют как суспензионную в дозе 10- 100 тыс. клеток в 1 мл 1 раз в 5 дней или в дозе более 100 тыс. клеток в 1 мл 1 раз в 3 дня.
Клетки штамма НЕ25 культивируют в организме животных. Интактным мьш1ам 5 линии BALB/C за 10 дней до инъекции вводят по 0,5 мл пристава. Штамм инъецируют в/брюшинно по 1-5х хЮ клеток в 1 мл ср еды Игла. Асцит образуется через 12-16 дней. Возможна 0 по крайней мере двухкратная перевивка штамма.
Продуктивность штамма..
Секреция моноклональных антител на 3-4-й день культивирования зависит 5 от посевной дозы и варьирует в диапазоне от 1 до 10 мкг/мл культуральной среды и 10 мг/мл асцитической жидкости. Концентраи 1Ю антител определяют иммуноферментным методом.
Стабильная продукция антител сохраняется до 20-го пассажа in vitro.
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и при посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК.
Криоконсервирование.
Клетки штамма консервируют по 1х х10 клеток/мл коровьей сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ампул проводят в коробке из вспененного полистирола с толшдной стенок g 1 см. Коробку с ампулами оставляют при - 70°С и через сутки переносят ампулы в жидкий азот для хранения.
Размораживание проводят быстро в водяной бане при 37 С. Жизнеспособ0
5
0
10
15
ностъ после рачморгшивания по включению трипаиоиого синего 60%.
Характеристика полезного продукта.
Моноклональные антитела относятся к классу IgGl. Антитела спеп.ифически связываются с антигенами на поверхности эндотелиальных клеток пупочной вены человека, а также с гладкомышеч- ными клетками из аорты человека в культуре.
Пример 1. Культуральную среду от штамма НЕ25, содержащую монокло- нальные антитела в концентрации 10 мкг/мл, собирают, центрифугируют в течение 10 мин при 800 g. Надоса- дочную жидкость используют как реагент для изуче ния специфичности связывания антител с компонентами сосудистой стенки человека.20
11летки-мишени высевают в 96-луноч- ные панели из полистирола, вьфащивают до достижения монослоя в соответствующей среде с сывороткой, отмывают от сорбировавшихся белков забуференным физиологическим раствором (ЗФР) и, если необходимо, фиксируют в 4%-ном формальдегиде в изотоническом солевом растворе 5 мМ NaH,,P04 , 140 мМ NaCl, 1 мМ CaCl, 1 мМ . После 20 мин фиксации при 20°С избыток формальдегида отмывают ЗФР. Затем несорбиро- вавшийся на пластике белок удаляют, ячейки промывают 5 раз, вносят в них по 50 мкл культуральной среды от штамма НЕ25 и инкубируют 30 мин при 37 С, Несвязавшиеся антитела отмьшают ЗФР 5 раз, в ячейке вносят ковалентно связанные с пероксидазой хрена антитела кролика против иммуноглобулинов мыши в 50 мкл среды 199 с 10% телячьей сыворотки. Через 30 мин инкубации при 37 С несвязавшиеся антитела отмывают указанным способом, а количество оставшейся в ячейках перокси- дазы, пропорциональное количеству антител, определяют по расщеплению субстрата () в присутствии хромогена ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется изменением окрашивания от желтого до коричневого и просчитывается на спектрофотометре при длине волны 490 нм.
оптической плотности, при длине волны 490 нм представлены в таблице.
Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с эндотелиальныь5И клетками пупочной и легочной артерии по отношению к фиб- робластам кожи в диапазоне исследованных концентраций.
Специфичность по отношению к глад- комьш1ечным клеткам относительна.
Пример 2. Культуральную среду от штамма НЕ255 содержащую антитела, получают так же как в примере 1 .
На дно ячеек 96-ячеечной полистироловой панели сорбируют коллаген I, III, IV и V-типов, фибриноген и фибронектин человека, с которыми определяют связывание антител. Для этого в ячейки вносят по 50 мкл раство ра белка в 200 мМ бикарбонатном буферном растворе рН 9,О с концентрацией 25 10 мкг/мл и оставляют на 16ч при 4°С, После трехкратной промывки ЗФР в ячейки вносят по 500 мкл культу- ральной среды от штамма НЕ25 и инкубируют 30 мин при 37°С. Дальнейшие промывки, инкубацию с антителами кролика против иммуноглобулинов МЬ1ШИ,
кон7зюгированным1 с пероксидазой, и проявление реакции связывания проводят также, как описано в примере 1.
Измерение оптической плотности при 490 нм показывает, что в диапазоне концентраций антител от 0,15 до 10 мкг/мл связывание lix с коллагенами, фибриногеном и фибронектином че
30
35
40
45
ловека не вьивляется, оптическая плотность в ячейках 0,050 и не зависит от концентрации антител. В тех же условиях и в тех же диапазонах концентраций антитела, полз ченные к коллагенам I и III типов реагируют, давая величину оптической плотности 0,070 - 0,920, а антитела к фибронек- тину - 0,060-0,500 при взаимодействии с коллагенами I, III типов и фибронектином соответственно.
Таким образом, реакция исследуемых антител с коллагенами I, III, IV и V типов, фибронектином и фибриногеном человека отсутствует.
Результаты экспериментов по изуче-55 Формула изобретения нию специфичности связывания иммуноглобулинов из культуральной средыШтаьм гибридных культивируемых штамма НЕ25 с различными культивируе- клеток мыши Mus musculus BCKK(n)N33D мыми клетками, вьфаженные в единицах (Специализированная коллекция переви50
0
5
оптической плотности, при длине волны 490 нм представлены в таблице.
Результаты, приведенные в таблице, свидетельствуют о высокой специфичности взаимодействия антител с эндотелиальныь5И клетками пупочной и легочной артерии по отношению к фиб- робластам кожи в диапазоне исследованных концентраций.
Специфичность по отношению к глад- комьш1ечным клеткам относительна.
Пример 2. Культуральную среду от штамма НЕ255 содержащую антитела, получают так же как в примере 1 .
На дно ячеек 96-ячеечной полистироловой панели сорбируют коллаген I, III, IV и V-типов, фибриноген и фибронектин человека, с которыми определяют связывание антител. Для этого в ячейки вносят по 50 мкл раство ра белка в 200 мМ бикарбонатном буферном растворе рН 9,О с концентрацией 5 10 мкг/мл и оставляют на 16ч при 4°С, После трехкратной промывки ЗФР в ячейки вносят по 500 мкл культу- ральной среды от штамма НЕ25 и инкубируют 30 мин при 37°С. Дальнейшие промывки, инкубацию с антителами кролика против иммуноглобулинов МЬ1ШИ,
кон7зюгированным1 с пероксидазой, и проявление реакции связывания проводят также, как описано в примере 1.
Измерение оптической плотности при 490 нм показывает, что в диапазоне концентраций антител от 0,15 до 10 мкг/мл связывание lix с коллагенами, фибриногеном и фибронектином че
0
5
S . 1362746 .
ваемых соматических клеток позвоноч- нальных антител к поверхности эндоте- ных Института цитологии АН СССР) , лиальных клеток пупочной вены чело- используемый для получения монокло- века.
Клетки
Концентрация антител, мкг/мл 10 Т 2,5 Т 0,6 Г 0,3 Т 0,15
0,800 0,760 0,600 0,200 0,100
0,807 0,760 0,610 0,215
0,250 0,230 0,180 0,130 0,040
0,100 0,100 0,100 0,100 0,100
. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при идентификации иммуногистохи- мических срезов органов и тканей человека и типировании опухолей эндо- телиального происхождения. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши MUS musculus,.длительно продуцирующего моноклональные антитела (МА) к поверхности эндотелиальных клеток пупочной вены человека. Штамм НЕ25 получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB / С, иммунизированных суспензией эндотелиальных клеток, с клетками миеломы F3/Ag 8.653. Штамм вы-- водят в массовую культуру. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК (n)N33D и характеризуется следующими признаками. Клетки штамма культивируют в пластиковых флаконах в среде RPMI 1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5% СО при 37 С, При культивировании в организме жи- : вотных асцит образуется через 12- 16 дней. Концентрация МА в асцитичес- кой жидкости составляет 10 мг/мл, в kyльтypaльнoй - 1-10 мкг/мл. МА относятся к классу IgGl. Они специфически связьшаются с антигенами на поверхно- со-и эндотелиальных клеток из пупочной вены человека, а также с гладкомышеч- ными клетками из аорты человека в культуре. 1 табл. с S (Л
