Способ получения суммарного гистонаиз жиВОТНОгО СыРья Советский патент 1981 года по МПК A01N63/00 

3 ч. Выход хроматина составляет 70% (по дезоксирибонуклеиновой кислоте). Осадок хроматина суспендируют в 0,01 М трис-буфере, рН 3, и диализируют против того же буфера в течение 18 ч. После диализа осадох хроматина растворяют в 10 объемах 0,015 М NaCl + 0,001 М натрий линоннокнслый. Нерастворившиеся частицы удаляют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 30 мин. К полученному раствору добавляют 1/4 объема 1 н. H2SO4, перемешивают в течение 30 мин и центрифугируют 20 мин при 1200 об/мин. Экстракт сохраняют. Осадок после центрифугирования повторно обрабатывают уже 0,4 н. H2SO4 (1/4 объема) и экстракты объединяют. К объединенным экстрактам добавляют 4 объема охлажденного абсолютного этанола. Смесь выдерживают 24 ч при -10°С. Выпадает осадок суммарного гистона. Осадок собирают центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в абсолютном этаноле и центрифугируют при 10000 об/мин. Промывание осадка этанолом повторяют еще два раза, после чего его высушивают. Препарат суммарного гистона, полученный этпм способом, характеризуется следуюш,имИ показателями: содержание белка 90%, примеси негнстоновых белков 10%, содержание фракции аргининбогатых до 30-50%, бактерицидная активность гистонов не исследовалось.

Указанный способ имеет следующие недостатки:

Конечный продукт имеет недостаточную чистоту - до 10% негистоиовых примесей; в нем отсутствуют определенные . фракции гистонов (аргининбогатые) из-за их агрегации с примесными негистоновыми белками, неполноты осаждения из раствора прн использовании этапола.

Осаждение суммарного гистона нз кислотного экстракта этанолом не обеспечивает выделение фракций аргипинбогатых гистонов, IB состав которых входит значительное количество неполярных аминокислот, в силу чего они находятся в растворимом состоянии в этаноле.

Бактерицидная активность в суммарном препарате сниженная за счет отсутствия фракций аргининбОГатых гистонов.

Целью изобретения является повышение чистоты, выхода и сохранение бактерицидной активности конечного продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения суммарного гистона из животного сырья, включающем гомогенизацию в буферном растворе при рН 8, осаждение и промывку хроматина, экстракцию и осаждение гистона, в раствор гомогенизации вводят лимоннокислый натрий и бисульфит натрия, экстракцию суммарного гистона проводят непосредственно из осадка хроматина, а осаждение осуществляют ацетоном в течение 0,5-1,0 часа при

температуре -f4°С, причем объемное соотношение экстракта и ацетона равно 1 :7-10.

Изобретение обеспечивает содержание белка не менее 98%, содержание примеси негистоновых белков 1-2%, содержание фракций аргининбогатых гистонов 80- 95%.

Бактерицидная активность сохраняется 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Обеспечение чистоты препарата суммарного гистона, т. е. исключение содержания в нем негистоновых белков, достигается экстракцией суммарного гистона непосредственно из осадка хроматина.

Хроматин ядер клеток животных представляет дезоксирибонуклеопротендный комплекс (ДНП) с рибонуклеиновой кислотой, с двумя классамн белков: белки основного характера - гистоны, на долю носледних приходится 70-80% от общего количества белков хроматина и кислые белки - ядерные ферменты.

Известно, что прн растворении хроматина в растворах низкой ионной силы нарушается пространственная структура ДНП и при этом гистоны могут формировать комплексы с негистоновыми белками. При последующем извлечении гистонов из раствора хроматина негистоновые белки могут соэкстрагнроваться с гистонами и тем самым загрязнять конечный продукт.

Прием экстракции суммарного гистона непосредственно из осадка хро-матина обеспечивает полную и избирательную экстракцию гистонов и позволяет избежать загрязнения препарата негистоновыми белками, так как последние остаются связанными с ДНК.

Для обеспечения максимального выхода суммарного гистона, содержащего все пять фракций гистона, в предлагаемом способе в раствор при гомогенизации ткани вводят натрий бисульфит и натрий лимоннокислый для ингибирования протеиназ, что исключает протеолиз фракций гистонов HI н Н4.

Выход полноценного конечного продукта, содержащего все пять фракций гистонов (HI, Н2А, Н2В, НЗ, Н4) в эквимолярном соотношении (20% ло весу) достигается использованием высоких объемов ацетона (при объемном соотношении экстракта и ацетона 1:7-10), а также проведением процесса осаждения при -Ь4°С в теченне 0,5-1 ч, так как в данных условиях все фракции гистонов находится в пативной аформе в нерастворимом состоянии.

Получение суммарного препарата, содерлсащего пять фракций гистона, обеспечивает его высокую бактерицидную активность в отношении Е. соИ. Пололсительный эффект наблюдается при добавлении 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем.

Свежезамороженный тимус телят измельчают на мясорубке и по порциям гомогенизируют с буферным раствором рН 8, содержащим 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфата и 0,01 М натрия лимоннокислого.

Гомогенат фильтруют через два слоя марли, через четыре слоя марли, потом через восемь слоев марли. Фильтрат центрифугируют. Осадок собирают я промывают буферным раствором рН 8. Осадок гомогенизируют с 0,4 н. серной кислотой и выдерживают при +4°С 10-12ч.

Экстракт отделяют центрифугированием и фильтруют.

К экстракту прибавляют охлажденный, подкисленный ацетон в объемных соотношении экстракта и ацетона 1 :7-10 и выдерживают 0,5-1 ч при +4°С.

Осадок суммарного гистона собирают на фильтре, промывают ацетоном и высушивают.

Содержание белка не менее 987о. Чистота по электрофрезу наПАГЭ: содержит все пять фракций; нримеси негистоновых белков до 1-2%.

Бактерицидная активность - 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Пример 1. 2 кг свежезамороженного тимуса телят измельчают на мясорубке и измельченную массу по порциям гомогенизируют с 10 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита и 0,01 М натрия лимоннокислого, рН 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и потом через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин при О-4°С.

Осадок собирают и заливают 4 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита и 0,01 М. натрия лимоннокислого, рН 8.

Смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С.

Осадок собирают и измеряют его объем. Осадок суспендируют в 4 л 0,4 н. раствор серной кислоты и по порциям гомогенизируют.

Гомогенизированную смесь оставляют экстрагироваться при О-4°С в течении 10-12 ч.

После экстрагирования смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С.

Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли. К фильтрату при перемешивании приливают 7 объемов охлажденного подкисленного ацетона (1 мл конц. №504 иа 2 л ацетона). Суспензию выдерживают при +4°С 1 ч.

Осадок гистона суммарного оседает на

ДНО сосуда. Надосадочный слой сливают. Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтруя суспензию через стеклоткань. Отфильтрованный осадок высушивают на воздухе до исчезновения запаха ацетона, потом сушат в вакуумэксикаторе над. едким кали.

Выход: 20 г гистона суммарного; содержание белка 100%; чистота по электрофорезу в полиакриламидном геле: содерлшт все пять фракций примеси негистоновых белков - следы.

Бактерицидная активность - 1 мл суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Пример 2. 1,8 кг свежезаморолсенного тимуса телят измельчают на мясорубке и измельченную массу по порциям гомогенизируют с 9 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита, 0,01 М натрия лимоннокислого, рЫ 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, темпесатура О-4°С.

Осадок собирают и заливают 3,5 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита, 0,01 М натрия лимоннокислого рН 8.

Смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С.

Осадок собирают и измеряют его объем. Осадок суспендируют в 3,5 л 0,4 н. раствора серной кислоты н по порциям гомогенизируют.

Гомогенизированную смесь оставляют экстрагироваться при О-4°С, в течение 10-12 ч. После экстрагирования смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С.

Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты и марли. К фильтрату при перемешивании приливают 10 объемов охлажденного, подкисленного ацетона (1 мл конц. H2SO4 на 2 л ацетона). Суспензию выдерживают при -f 4°С 0,5 ч.

Осадок гистона суммарного оседает на дно сосуда. Надосадочный слой сливают. Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтруя суспензию через стеклоткань.

Отфильтрованный осадок высушивают на воздухе до исчезновения запаха ацетона, йотом cyniaT в вакуум-эксикаторе над едким кали.

Вывод: 20 г гистона суммарного; содержание белка 99,5%; чистота по электрофорезу в полиакриламидном геле: содержит все пять фракций, примеси негистоновых белков - следы.

Бактерицидная активность - 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Пример 3. 2 кг свежезамороженного тимуса телят измельчают на мясорубке и измельченную массу по порциям гомогенизируют с 10 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита и 0,01 М натрия лимоннокислого, рН 8.

Гомогенат фильтруют через два, через четыре и потом через восемь слоев марли.

Фильтрат центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4Х.

Осадок собирают и заливают 4 л раствора, содержащего 0,14 М натрия хлористого, 0,05 М натрия бисульфита, 0,01 М натрия лимоннокислого, рН 8.

Смесь центрифугируют .при 1500 об/мин, в течение 15 мин, температура .

Осадок собирают и измеряют его объем. Осадок суспендируют в 4 л 0,4 н. серной кислоты и по порциям гомогенизируют.

Гомогенизированную смесь оставляют экстрагироваться при О-4°С в течение 10-- 12 ч. После экстрагирования смесь центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, температура О-4°С. Надосадочную жидкость собирают и фильтруют через слой ваты И марли.

К фильтрату при перемешивании приливают 9 объемов охлажденного подкисленного ацетона (1 мг конц. H2SO4 на 2 л ацетона).

Суспензию выдерживают при температуре 4°С в течение 45 мин. i Осадок гистона суммарного оседает на дно сосуда. Надосадочный слой сливают. Осадок двухкратно промывают неподкисленным ацетоном, собирают, фильтруя суспензию через стеклоткань.

Отфильтрованный осадок высушиваюг на воздухе до исчезновения запаха ацетона, потом сушат в вакуум-сушильном эксикаторе «ад едким кали.

Выход 20 г гистона суммарного; содержание белка 98%; чистота по электрофорезу на ПАГЭ: содержит все пять фракций; примеси негистоновых белков 0,5%.

Бактерицидная активность - 1 мг суммарного гистона на 1 мл бактериальной суспензии.

Технико-экономический эффект изобретения заключается в выделении суммарного гистона высокого качества: не содержащего негистоновых примесей, обладающего хорошей растворимостью, содержащего все пять фракций и обладающего бактерицидной активностью.

Таким образом, получение высококачественного препарата суммарного гистона обеспечит его применение в научных исследованиях в области молекулярной биологии (изучение структуры хроматинов в модельных опытах), в препаративной биохимии (получение отдельных фракций), как субстрата при ферментативных реакциях (опыты по ацетилированию и фосфорилиронанию гистонов), при исследованиях антибактериальных и антивирусных свойств и з практической медицине (при лечении ряда кожных заболеваний). Способ легко осуществим в промышленных условиях и по сравнению с известным способом дает экономию 3000 руб. на 1 кг продукта и обеспечивает экономию сырья, материалов и рабочего времени.

Формула изобретения

Способ получения суммарного гистона из животного сырья, включающий гомогенизацию в буферном растворе при рН 8,

осаждение и промывку хроматина, экстракцию и осаждение гистона, отличающийс я тслМ, что, с целью повыщения чистоты, выхода и сохранения бактерицидной активности конечного продукта, в раствор гомогенизации вводят лимоннокислый натрий и бисульфит натрия, экстракцию суммарного гистона проводят непосредственно из осадка хроматина, а осаждение осуществляют ацетоном в течение 0,5-1,0 ч при 4°С, при

чем объемное соотношение экстракта и ацетона равно I :7-10,

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

45.

1.G. Molec. Biology, v. 1, p. 1-20, 1959.

2.Methods in Cell. Biology, v. 17, ch. 3. p. 27-50, 1978.

3.Methods in Enzymology, v. 12. part. В., 60 sect. 5, p. 65-84, 1968.

4.Methods in Enzymology, v. 12, part. В., sect. 1, p. 3-65, 1968 (прототип).