Способ получения ферментного препарата -маннаназы Советский патент 1981 года по МПК C12N9/42 C12R1/125 

точники углерода, азота и минеральные соли, выделение фермента осуществляют путем осаждения трехкратным объемом этилового спирта при рН 5,0-5,2 и температуре и флокуляцией с помощью полиакриловой кислоты при рН 4,3-4,4 в соотношении полиакриловая кислота:белок 0,06:1 с последующим осаждением флокулянта раствором хлористого каль ция при рН 6,2-7,0 и лиофилизацией полученного ферментного раствора. Кроме того, раствор хлористого кальция используют в 10-50%-ной концентрации. Существенными отличиями предлагае мого способа являются использование в качестве продуцента штамма BaciPEu sufti is G-78, проведение культивирования в течение 16-20 ч и условия выделения фермента из культуральной жидкости. Предлагаемый способ позволяет до тичь выхода, целевого продукта до 79 Средняя активность ферментного препарата ji-маннаназы 540-10° ед/г препарата. Предлагаемый способ получения препарата р -маннаназы является простым в практическом применении, менее продолжительным, позволяет получить ферментный препарат fi -ман наназы высокой степени очистки и с хорошим выходом. Способ не требует применения дорогостоящих ионитов и технологически сложных и длительных стадий хроматографии. Это дает возможность снизить трудоемкость процесса получения препарата {i -маннан зы и значительно его удешевить. Предлагаемый способ легко может быт масштабирован в производственных условиях. . Способ осуществляется следующим образом. В качестве продуцента |Ь-маннана зы используют штамм BaciKKus suftiE G-78, .засев продуцента производят при рН 6,7 + 0,1, культивирование проводят при , продолжительност культивирования 18 + 2 ч. По окончании роста культуры биомассу отделяют фильтрацией. Фильтра подкисляют разбавленной уксусной кислотой до рН 5,0-5,2 и осаждают тремя объемами этилового спирта. Ос дение проводят охлажденным этиловым спиртном при2-4с. Осадок собирают филь-йрацией или центрифугированием, после чего растворяют в минимальном количестве подкисленной уксусной кислотой до рН 4,3-4,4 воде и произ водят флокуляцию 1% раствором полиакриловой кислоты. Флокуляцию прово дят при комнатной температуре. Обра зовавшийся осадок отделяют центрифугированием или фильтрацией. Полученный осадок растворяют в воде и сухим углекислым натрием доводят рН до 6,5. После этого флокулянт осаждают 20%-ным раствором хлористого кальция. Осажденный флокулянт отделяют центрифугированием, а полученный ферментный раствор лиофильно высушивают. Пример. Для получения высокоочищенного ферментного препарата fi маннаназы в качестве продуцента используют штамм BaciEEus suftiBis G-78, Питательную среду готовят следующего состава,%: крахмал - 6,5; кукурузный экстракт - 2,7; сухие пивные дрожжи -0,12; (NH4)-iHPO j - 0,5; K2S04 - 0,33; МдЗОф 7 Еу.О - 0,016; MnSO - 0,1; СаСе,2. - 0,013. Культивирование проводят на бродильных установках типа Биолафит. Для охлаждения этилового спирта используют холодильную установку Ультракриомат. Стерильную питательную среду при , рН 6,7 засевают штаммом BacieEus suftifis G-78. В течение двух часов температура снижается до 37°С, которую и поддерживают во время всей ферментации. В начале ферментации рН снижается до 6,1+0,1, потом повышается и в дальнейшем рН автоматически поддерживают в пределах 6,4-6,6. Продолжительность ферментации 18 + 2 ч. Конец ферментации определяют по максимальной ферментативной активности р-маннаназы. За условную единицу активности принято такое количество фермента, которое уменьшает относительную вязкость галактоманнана (полигалактоманнан из семян Ceratonia siKigua, фирма Sigma, США) на одну миллиединицу за одну минуту при 40°С. По окончании ферментации культуральную жидкость охлаждают до и отделяют биомассу фильтрованием. К 10 л охлажденного До 2°С и подкисленного разбавленной уксусной , лотой до рН 5,0-5,2 фильтрата постепенно добавляют 30 л охлажденного до этилового спирта. При этом температуру смеси поддерживают около . Образовавшийся осадок отфильтровывают и промывают одним литром этилового спирта. Далее осадок растворяют в 1 л воды, подкисленной уксусной кислотой до рН 4,35, и добавляют флокулянт (1% раствор полиакриловой кислоты) из расчета 0,06 мг ПАК на 1 мг белка. Полученный осадок центрифугируют 30 мин, 6000 об/мин. Далее осадок растворяют в 100 мл воды, предварительно подщелачивая До рН 6,5 сухим углекислым натрием. К полученному раствору добавляют 20% раствор CaCgji из расчета 0,78 вес.ч. CaCSg на 1 вес.ч. ПАК. Осажденный флокулянт отделяют центрифугированием

20 мин, 8000 об/мин, а полученный ферментный раствор лиофильно высушивают .

Средние показатели процесса получения высокоочищенного препарата р-маннаназы представлены в таблице.

Фильтрат,

(10 л) 342-10 20-10 17-10 1

Формула изобретения

100

при рН 4,3-4,4 в соотношении полиакриловая кислота : белок 0,06:1 с последующим осаждением флокулянта

раствором хлористого кальция при рН 6,2-7,0 и лиофилизацией полученного ферментного раствора.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Takenishi S«, Nippon Nogei Kagakl. Kaishi, 1972, 46, 155-161.

2.Shigenori Emi, Gnlhiro Fukmnoto, Takeriiko yamamoto. Criata ttisation and Some, Properties of Mannanase.llAgr. Biot. Chem, 1972, voe.36V26, 991-1001 (прототип).