Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата руссулин Советский патент 1981 года по МПК C12N9/50 A23C19/32 

Изобретение относится к производству микробиальных заменителей сычужного фермента для сыродельной промышленности. Известен способ получения фермента медицинского назначения Руделина, пре дусматривагодщй культивирование продуцента Russula decolorans (штамм 2) на жидкой питательной среде, в состав которой вводят 5,0-20 г/л кукурузной муки. После осаждения эталоном белкот вый раствор смешивают с фракционированной микрокристаллической целлюлозой из расчета 8,5-11,5 г/л и фильтруют с использованием нетканых материалов из полипропилена, а фильтрат подвергают ультрафильтрации l. Недостаток известного способа сложность технической схемы, обусловленная необходимостью получения высоко активного препарата, а также низкая эффективность процесса ультрафильтрации водных экстрактов фермента. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин, предусматривающий культивирование его продуцента Riissula decolorans (штамм 2) на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходи- мые минеральные соли в условиях аэрации с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и его сушкой 2 j . Недостаток известного способа его низкая эффективность и небольшой выход фермента. Целью изобретения является упрощение способа и увеличение выхода фермента. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, предусматривающему культивирование его продуцентаRussul а xdecblorans (штамм 2) на жидкой питательной среде, содержащей истонникиуглерода, азота, необходимые минеральные соли в условиях аэрации с последующим вьщелением целевого про дукта из фильтрата культурально жидкости и его сушкой, выделение фермент ного препарата проводят путем ультрафильтрации фильтрата культуральной жидкости до содержания сухих веществ 4-6% с последующей распылительной сушкой ультраконцентрата при рН 5,05,5, причем для мембран на основе аце тата цеплкшозы рН ультрафильтрации ус танавливают 5,5-5,7. Кроме того, при содержании фермент в грамме сухих веществ фильтрата куль туральной жидкости 30-60 тыс, ад. полученный ультраконцентрат диафильтруют водой с рН, равным рН ультраконцен трата, до удельной активности фермент 125-130 тыс. ед./г споследующей ульт рафильтрацией диаконцентрата или его непосредственной подачей на сушку. Технология способа состоит в следующем . Культура высшего базидиального гри ба Russula decolorans (штамм 2) выращивается на питательной среде, содержащей, %: кукурузная мука 1,0-1,8; гидролизные дрожжи 0,2-0,3; калий хлористый 0,1; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,4-0,06; калий фосфор нокислый двухзамещенный 0,02-0,|р4; магний сернокислый 0,05-0,07; натрий азотнокисльй 0-0,3; рН питательной среды 5,3-5,5, температура ферментации 25-2бС, избыточное давление 0,03 0,05 МПа, подача стерильного воздуха в количестве 0,5 объема на один объем среды в минуту. Продолжительность процесса ферментации 110-150 ч. После ферментации получаем культуральную жидкость с грибным запахом, светло-коричневого цвета., имеющую во Бзвещенном состоянии гифы мицелия гри ба в виде шариков или нитей различной величины в количестве 4-7 г/л, рН 3,5 5,0; молокосвертывающая активность {МА} 400-200 ед/мл. Культура гриба охлаждается до 18-20с и освобождается от мицелиальной массы фильтрацией через плотную ткань типа бязь. Отделенную от культуральной жидкости биомассу сушат с целью ее дальнейшего использования в сельском хозяйстве, а фильтрат подвергают очистке от взвешенных частиц сепарированием с последующей его холодной стерилизацией через асбестоцеллюлозные пластины марки СФ, причем для мембран на основе ацетата целлюлозы /например, полимерные пленки типа Владипор марки УАМ100 перед сепарированием фильтрат культуральной жидкости доводят концентрированным раствором МаОН до рН 5,5-5,7. Фильтрат культуральной жидкости после предварительной обработки с содержанием сухих веществ 0,4-0,6%, ХПК 1300-1500 подают на ультрафильтрацию через полупроницаемые мембраны, на 98-100% задерживающие молекулы фермента Руссулин, например мембраны марки УАМ-100. Во избежание термической инактивации фермента температура фильтрата культуральной жид-кости в процессе ультрафильтрации поддерживается равной 18-20 С. Ультрафильтрацию проводят до содержания сухих веществ 4-6%. Пои этом в ультрафильтрат проходит 95-98% всего объема фильтрата культуральной жидкости, 50-70% низкомолекулярных соединений и балластных белков, в результате чего удельная активность фермента возрастает в 2-3 раза. Если начальное содержание фермента в грамме сухих веществ фильтрата культуральной жидкости 60-100 тыс. ед/г, ультраконцентрат доводят ледяной уксусной кислотой или концентрированным раствором едкого натра 5,0-5,5 и подают на распьшительную сушку с температурой на входе 120-130с, на выходе 60-70 С, причем ультраконцентрат, полученный на ацетатцеллюлозньгх мембранах подается на сушку непосредственно после ультрафильтрахдаи. После сушки получают мелкодисперсныйf однородный порошок светло-коричневого цвета, 1 t которого растворяется в течение 10 мин в 100 №1 воды при 35с, что соответствует требованиям, предъявляемым сыродельной промьшшенностЬю к микробиальным заменителям сычужного фермента. Препарат станаартизуют поваренной солью до МА iOO + 5 тыс. ед/п а ультрафильтрат, имеющий ХПК 400 500 мг02/л и СВ 0,3-0,6%, частично используют для приготовления исходной питательной среды или подают на биологическую очистку. Если начальная удельная активность фильтрата культуральной жидкости составляет 30-60 тыс. ед/г, полученный ультраконцентрат диафильтруют водой с рН, равным рН ультраконцентрата, до удельной активности фермента 125130 тыс. ед/г. Диаконцентрат дополнительно ультрафильтруют до СВ 4-6% с последукицим доведением рН до 5,05,5 и подачей на сушку,или непосредственно подают на сушку после доведе ния рН, а диафильтрат и оба ультрафильтрата смешивают (ХПК смеси 350450 мг 02/л, СВ 0,3-0,5% и использу ют частично для приготовления исходной питательной среды или подают на биологическую очистку. В таблице приведены данные по выходу промежуточных продуктов по стад ям получения ферментного препарата Руссулин с применением методов осаждения и ультрафильтрации. Как видно из таблицы, применение ультрафильтрации с последующей распьшительной сушкой ультра- или диаконцентрата упрощает технологию получения ферментного препарата и существенно увеличивает его выход по МА. Пример 1. Культура гриба RIssula decolorans (итамм 2) выращи..вают на питательной среде,содержащей % кукурузная мука 1,8; гидролизные дрожжи 0,3; калий фосфорнокислый одн замещенный 0,06; калий фосфорнокиспый двузамещенный 0,04; магний серно кислый 0,05; калий хлорж.стый 0,1; на рий азотнокисльм 0,2. Ферментацию проводят при 25 С в течение 140 ч, избыточное давление 0,05 МПа, подача стерильного воздуха в количестве 0,5 объема на один объем среды в минуту. Полученную культу ральную жидкость охлаждают до I8-20 и отделяют от нее мицелий гриба. Отделенную от культурапьной жидкости биомассу сушат, а фильтрат доводят 30% раствором NaOH до рН 5,7 и подаю на сепарирование с последующим его Осветлением и холодной стерилизацией через асбестоцеллюлозные пластины ма ки СФ. Выход фермента на стадии пред варительной обработки культуральной жидкости 92%. 310 л фильтрата культуральной жид кости с рН 5,7; СВ 0,5%; МА 360 ед/мл (удельная МА 72 тыс. ед/г), ХПК 1320 подают на ультрафильтрацию через ацетатцеллюлозные мембраны с. эффективным диаметром пор 100 А. В процессе ультрафильтрации температ ра фильтрата культуральной жидкости поддерживается равной 18-20 С. Ультрафильтрацию проводят до 4,2% СВ. Пр этом в ультрафильтрат проходит 95% начального объема фильтрата культуральной жидкости, 58% низкомолекуляр ных веществ и балластных белков. В результате получают 15,5 л ультраконцентрата с МА 6480 ед/мл (удельная МА 154 тыс. ед/г), рН 5,5. Выход фермента на стадии ультрафильтрации 90%. Ультраконцентрат подают непосредственно на распыпительную сушку с температурой на входе 125С, на выходе . После сушки получают 573 г ферментного препарата с МА 124 тыс. ед/г, 1 г которого в течение 10 мин растворяется в 100 г воды при 35 С. Выход фермента на стадии сушки 705%; общий выход 58%, выход ферментного препарата по весу в пересчете на стандартную активность 2,3 г/л культуральной жидкости. Дпя получения стандартной активности к полученному препарату в качестве наполнителя добавляют ПО г поваренной соли. Ультрафильтрат в количестве 294,5 л с содержанием сухих веществ 0,3% и ХПК 440 направляют на биологическую очистку. Пример 2. 80 л прошедшего предварительную обработку (выход фермента на стадии 92%) фильтрата культуральной жидкости Руссулина с рН 5,6; СВ 0,6%; МА 250 ед/мп (удельная МА 42 тыс. ед/г),-ХПК 1450 мг подают на ультрафильтрацию через ацетатцеллюлозные мембраны с эффективным диаметром пор 105 А. В процессе ультрафильтрации температуру фильтрата культуральной жидкости поддерживают равной 18-20 С. Ультрафильтрацию проводят до 5,6% СВ. При этом в ультрафильтрат проходит 96% начального объема фильтрата культуральной жидкости, 63% низкомолекулярных веществ и балластных белков. В результате получают 3,2 л ультраконцентрата с МА 5950 ед/мл (удельная МА 106 тыс. ед/г),-рН 5,5 и 76,8 л ультрафильтрата с СВ 0,39%; ХПК 420 мг02/л. Выход фермента на стадии ультрафильтрации 95%. Ультраконцемтрация 10 л воды, доведенной до рН 5,5, диафильтруют до содержания фермента в грамме сухих веществ 130 тыс. ед., при этом содержание сухих веществ в диаконцентрате снижается до 4,5%. Выход фермента на стадии диафильтрации 98%. Диафильтрат подают непосредственно на распьтительную сушку (получают 137 г препарата с МА 103 тыс. ед/г, выход фермента на стадии сушки 76%) или доролнительно ультрафильтруют до СВ 5,6%. После дополнительной ультрафильтрации получают 2,5 л ультраконцентрата и 0,7 п

78831

ультрафильтрата (выход фермента на стадии дополнительной ультрафильтрации 98%7. Ультрафильтрат подают на распылительную сушку, в-результате которой получают 126 г ферментного препарата s с MA 105 тыс. ед/г (выход фермента на стадии сушки 72%), а диафильтрат и оба ультрафильтрата смешивают (ХПКсмеси 390 мг 02/л, СВ 0,38%) и направляют на биологическую очистку. Общий Ю выход фермента 65% (с дополни.тельной

748

ультрафильтрадией 60%), выход ферментного препарата по весу в пересчете на стандарную активность составляет 1,7 г/л культуральной жидкости.

Применение ультрафильтрации с последующей распьшительной сушкой ультраконцентрата в технологии получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин позволит увеличить выход фермента и снизить затраты на его производство.

Предварительная обработка перед вакуум-выпа:риванием (отделение мицелия гриба, сепарирование)

Предварительная обработка перед ультрафильтрацией (отделение мицелия гриба, сепарирование, осветление)

Вакуум-выпаривание фильтрата культуральной жидкости

Ультра- и диафильтрация фильтрата культуральной жидкости

Осаждение фермента этиловым спиртом, отделение осадка, экстрагирование фермента водой

Лиофильная сушка концентра80-70 49-31 та Распылительная сушка концентратаСтандартизация, фасовка и 99-98 упаковка готового продукта

Примечание: Данные по выкоду промежуточных продуктов спиртоосажденного ферментного препарата взяты из опытно-промышленного регламента на производство ферментного препарата Ренниноруссулин Г 10 X, М., 1979.

95-92

91-81

96-88 75-70 68-57 48-3099-98 67-56

Формула изобретения

1, Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата Руссулин, предусматривающий культивирование его продуцента Russula decolorans (штамм 2) на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли в условиях аэрации с последующим выделением целевого продукта из фильтрата куль- туральной жидкости и его сушкой, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения выхода фермента, вьщеление ферментного препарата проводят путем ультрафильтрации фильтрата культуральной жидкости до содержания .сухих веществ 4-6% с последующей распылительной сушкой ультраконцентрата при рН 5,05,5, причем для Мембран на основе ацетата целлюатозы рН ультрафильтрации устанавливают 5,5-5,7.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2. Авторское свидетельство СССР 522230, кл. С 12 D 13/10, 1972 (прототип).