Способ получения ферментного комплекса Советский патент 1982 года по МПК C12N9/22 

Изобретение относится к способам получения ферментного комплекса, используемого для расщепления нуклеиновых кислот до нуклеотидов и озидов, которые находят широкое применение в медицине и научно-исследо.Эателькой работе в биохимии и молекулярной биологии. Ферментные комплексы, расщепляк щие нуклеиновые кислоты, содержат ферменты типа нуклеаэ и фосфатаз и получают как выделением из растительных и животных тканей, так и микробиологическим путем. Наиболее перспективными являются микробиологические способы. . Известен штамм Actinomyces coeCi- coPor Л-6б,продуцирующий ферментный комплекс, который содержит 5-экзонук леазу, фосфатазу и другие ферменты, причем активность 5-экзонуклеазы в условиях глубинного культивирования 400 ед/мл, а при культивировании в производственных условиях в ферментере. - 600 ед/мл 1 . Однако активность фосфатазы в комплексе очень низкая, в то же время он содержит высокоактивную дезаминазу, которая дезаминирует нуклеотиды, при этом сильно снижается выход целевого продукта - аденозина и гуанозина. Известен также способ получения З-экзонуклеазы, включающий культивирование Actinomyces coeCicoCor шт А-18 при 28-30 С и рН 6,9-7,2 на жидкой питательней среде, содержащей пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные Л-амилазой, сернокислый аммоний, мел и калий хлористый, и выделение фермента из культуральной жидкости осаждением органическим растворителем, в котором соотноленне ciL-амилаэы к пшеничной муке 0,5г;40г, мука, крахмал, сульфат аммония, мел и калий хлористый взяты в соотношении 2:2:0,6:0,6:0,1. Время культивирования 48ч при 30°С и аэрация 1 объем воздуха на 1 объем среды. Активность 5-экзонуклеазы в культуральной жидкости 400 ед/мл. Ферментный препарат из фильтрата культуральной жидкости 2,5 объемами ацетона при рН 5,5 в присутствии магния хлористого (1 г/л). Активность Б-экзонуклеазы в препарате 40 тыс.ед./г. Выход препарата с 1 м 8000 rt.2, Однако способ характеризуется отсутствием в сяцутим1лх количествах

фосфатазы и низкой ее активностью (следы), обусловленные недостаточным количеством катионов К в питательной среде, а также длительность культивирования (48 ч), в связи с тем, что гидролиз пшеничной муки и крахмала при соотношении с1-амилазы ГхЗХ к пшеничной муке 0,5 г на 40 г муки проходит не до конца и не создает необходимое содержание олигосахаридов в питательной среде, что замедляет рост биомассы и продуцирование ферментов.

Цель изобретения - повышение фосфатазной активности ферментного комплекса при сохранении высокой активности 5-экзонуклеазы, а также сокращение сроков культивирования продуцента.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу -получени ферментного комплекса, содержащему 5 -экзонуклеазу и фосфатазу, включающему культивирование Actinorayce coeeicoEor шт А-18 при 28-30с и рН 6,9-7,2 на жидкой питательной среде, содержащей пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные Ыамилазой, сернокислый аммоний, мел и хлористый калий, и выделение ферментов из культуральной жидкости путем осаждения органическим растворителем, в питательную среду дополнительно вводят активатор ферментов - хлористый марганец в концентрации 0,001-0,002% и пеногаситель силиконовое масло, при этом весовое соотношение d-амилазы к пшеничной муке составляет 1:(14-17), соотношение муки, крахмала и хлористого калия соответственно 1: (0., 6-0,7) : :(О,07-0,08), а осаждение конечного продукта осуществляют этиловым спиртом при соотношении культуральной жидкости и спирта 1:(3,5-4,5).

Введение в питательную среду марганца хлористого в концентрации 0,001-0,002% активизирует и стабилизирует ферменты 5 -экзонуклеазу и щелочную фосфатазу в проц. биосинтеза и вьзделения йз культурал ной жидкости. Использование силиконового масла в качестве пеноГасителя имеет то преимущество, что оно не обволакивает клетки мицелИя и не мешает выходу ферментов из .клетки, что способствует увеличению концентрации 5 -экзонуклеа и щелочной фосфатазы в культуральной жидкости. Проведение процесса гидролиза cL-амилазой при соотношении ot-амилазы к пшеничной муке 1:(14-17) приводит к более полному разложению полимерной молекулы полисахаридов на олигосахариды, неокрашиваемые йодом. Обог;ащение птательной среды олигосахаридами

сокращает лаг-фазу и время максимального накопления ферментов, что упрощает процесс получения ферментного комплекса за счет сокращения длительности культивирования на 812 ч. Соотношение пшеничной муки: (крахмала:калия хлористого 1:(0,60,7): (0,07-0,08) приводит к обогащению питательной среды аминокислотами и катионами калия. Это увеличивает количество биомассы и активирует продуцирование ферментов 5 -экзонуклеазы и щелочной фосфатазы.

Осаждение ферментного комплекса этиловым спиртом при соотношении культуральной жидкости к спирту

1:(3, , 5) -приводит к более полному осаждению щелочной фосфатазы из кyльтypaльнoй жидкости и обогащению

ферментного комплекса фосфатазой ; П .р и м е р 1. 15 кг пшеничной муки, разведенной в воде, заливают в ферментер, включают мешалку, доводят объем до 200 л и проводят стерилизацию муки острым паром при

2кгс/см в течение 2 ч. По окончании стерилизации давление в аппарате опускают, охлаждают до -95°С и загружают 10 кг растворимого крахмала, 0,9 кг « -амилазы (амилосубтили ГЗх) и проводят осахаривание. Затем загружают остальные компоненты, кг: аммоний сернокислый 3; мел 3; калий хлористый 1,05; марганец хлористый 0,005; силиконовое масло 0,20. Доводят объем до 500 л водой,

рН среды 6,9. После загрузки всех компонентов питательной среды ферментер Герметически закрывают и стерилизуют подачей пара в рубашку при i кгс/см в течение 1 ч. После окончания стерилизации 12 литров трех суточной глубинной культуры Actinomyces coeeicoPor шт. А-18 вливают в ферментер, включают мешалку и подают стерильный воздух в ферментатор для аэрации. Процесс ферментации проводят при 29-3О С, давление в ферментере 0,5 кгс/см, расход воздуха 30 MV4 при размешивании мешалкой со скоростью 300 об/мин. Выращивание ведут 40 ч. По окончании ферментации культуральную жидкость фильтруют. Получают 450 л фильтрата культуральной жидкости. В фильтрат добавляют 450 г магния хлористого и доводят рН до 5,5 с помощью 5 и. НСС. к охлажденнму фильтрату культуральной жидкости приливают 3,5 объема охлажденного до 4°С этилового спирта и сушат в вак5 ум-сушильных шкафах. Активность 5 -экзонуклеазы 44300 с/г. Активнос щелочной фосфатозы 910 с/г препарата.

Пример 2. К18кг пшенично муки в 200 л воды, простерилизованн

в ферментере острым.паром при 2 кгс/см добавляют 12,6 кг крахмала и 1,3 кг амилосубтилина ГЗх и проводят осахаривание. Затем загружают остальные компоненты, кг: аммоний сернокислый 3,6; мел 3,6; калий хлористый 1,5; марганец хлористый 0,0075; силиконовое масло 0,3. Доводят объем до 500 л водой. рН среды 7,2. 12 л трех суточной глубинной культуры ActincHnyces coeFicpCor шт. А-18 вливают в приготовленную питательную среду и подают стерильный воздух для аэрации при включенной мииалке.

Процесс ферментации проводят при |29с и давлении в ферментере 0,5 кгс/см, расходе воздуха 30 м/ч при размешивании мешалкой 240 об./мин Выращивание ведут в течение 36 ч. Активность 5 -экзонуклеазы в культуральной жидкости 480 ед/мл.

Культуральную жидкость фильтруют. Получают 460 л фильтрата культуральной жидкости. К культуральной жидкости добавляют 460 г хлористого магния и доводят рН до 5,5 с помощью 5 и. НСС. К охлажденному фильтрату культуральной жидкости приливают охлажденный этиловый спирт в соотношении 1:4,5 при перемешивании. После отстаивания в течение 20 мин суспензию фильтруют на нутч-фильтре. Осадок фермента прокивают этиловым спиртом и сушат в вакуум-сушильных шкафах. Активность 5 -экзонуклеазы 50100 е/г препарата. Активность щелочной фосфатазы 1020 е/г препарата.

Предлагаемый способ позволяет повысить активность фосфатазы в продуцируемом ферментном комплексе при сохранении высокой 5-экзонуклеазной активностях, а также сократить сроки культивирования проду цента.

Формула изобретения

Способ получения ферментного комплекса, содержащего -экзонуклеазу и фосфатазу, включающий культивирование Actinomyces coePicoPor шт А-18 при 28-ЗО С и рН 6,9-7,2 на жидкой питательной среде, содержащей пшеничную муку и крахмал, прогидролизованные с1-амилазой, сернокислый аммоний, мел и хлористый калий, и выделение ферментов из культуральной жидкости путем осаждения органическим растворителем, отличающийся тем,. что с целью повышения фосфатазной активности ферментного комплекса при сохранении высокой активности 5 -экзонуклеазы, а также сокращения сроков культивирования продуцента, в питательную среду дополнительно вводят активатор ферментов - хлористый марганец в концентрации 0,0010,02% и пеногаситель - силиконовое масло, при этом весовое соотношение й1-амилазы к пшеничной муке составляет 1: (14-17), соотношение муки, крахмала и хлористого калия соответственно 1:(0,6-0,7):(0,07-0,08), а осаждение осуществляют этиловым спиртом при соотношении культуральной жидкости и спирта 1:(3,5-4,5).

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Авторское свидетельство СССР 772224,кл. С 12 N 15/00, 1979.

2.Авторское свидетельство СССР по заявке 2659534/28-13,

кл. С 12 D 13/10, 1978 (прототип).