Способ определения фаголизосомальных структур клетки Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской цитохимии и может быть использовано для оценки СВОЙСТВ внутриклеточных структур. Известен ультрамикроскопический способ определения фаголизосомальны структур клеток путем выделения последних и культивирования в системе in vitro в течение нескольких суток с добавлением is инкубационную среду либОКоллоидного золота, либо торотраста l . Известен также способ, включающий получение клеток, фиксирование их раствором какого-либо альдегида, замораживание, криомикротомирование с проведением на заключительных этапах цитохимической реакции при рН 5,0 на лизосомальный фермент кислую фосфатазу с |3 -глицерофосфатом в качестве субстрата и ионами свинца в качестве контрастирующего агента pj . Недостатком известного способа является то, что предварительная ал дегидная фиксация подавляет активность кислой фасфатазы, что препятствует достаточно полному выявлению фермента и значительно снижает чувствительность известного способа. 3 процессе фиксации изменяется проницаемость биологических мембран, что может приводить к диффузии фермента и определению мест его Неистинной локализации. В процессе заморахсивания перед криомикротомиро нием происходят значительные по.вреждения клеток. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения фа голизосомальных структур клетки путем инкубации фагоцитов и фагоцитируемых частиц, последующего цитохимического выявления кислой фосфат зы и электронного микроскопического . исследования внутриклеточных структур, интактные фагоциты инкубируют в среде, содержащей буферный раство с рН 7,0-7,2 5-15 мМ ji -глицерофосфата и 2-5 мМ нитрата свинца. Способ осуществляется следующим образом. Полученные фагоцитирующие клетки в конечной концентрации 1 10- 3 -10./мл вносятся в содержащую фагоцитируемый материал инкубационн среду следующего состава: 120-160 м хлорид натрия; 3-7 мМ хлорид калия, 15-25 мМ Hepes , 3-7 мМ глюкoзa 5-15 мМ (3 -глицерофосфат и 2-5 мМ нитрат свинца, имеющую рН 7,0-7,2. После инкубации в течение 15-60 мин клетки осаждают центрифугированием, фиксируют 4%-ным раствором параформ альдегида, постфиксируют 1%-ным раствором четырехокиси осмия, обезв живают ацетоном с возрастающей кон- .:. центрацией последнего от 70 до 100%, заливают в смесь эпон-эралдит, полимеризуют в течение 48-60 ч, ультрамикротомируют и изучают в электронном микроскопе. Пример. Фагоциты получеиот промыванием брюшной полости мышей СВЧ Hepe-s - забуференной средой, содержащей 140 мМ NaCP ; 5 мМ KCl, 20 мМ Иерее (рН 7,2); 5 мМ глюкозы, кроме того, на 250 мл.этого раствора вносят 50 мг бычьего сывороточного альбумина и 5000 ед. гепарина. Клетки осаждают центрифугированием в течение 8 мин при 1200 об/мин на холоду. После этого осадок ресуспензируют в Hepes - забуференной среде с 0,2%-ным бычьим сывороточным альбумином и вновь центрифугируют при тех же режимах. Полученные клетки инкубируют в Hepes - забуференной среде, содержащей также 10 м14 3 -глицерофосфат и 3,6 мМ которую фильтруют перед использованием. В качестве фагоцитируемого материала используют частицы латекса, количество клеток в инкубационной среде составляет 1.10°/мл. Время инкубации 30 мин на водяной бане при З7с и постоян-i ном встряхивании (амплитуда 2, частота Hint versa 6-shaker type 327. Фагоцитоз останавливают добавлением в среду инкубации раствора параформальдегида на 10 мМ какодилатном буфере (конечная концентрация параформальдегида 1,5%). Клетки осаждают центрифугированием (3000 об/мин в те-, чение 10 мин при 4°С, фиксируют в . 4%-ном растворе параформальдегида на 100 мМ какодилатном буфере (.рН 7,2),,в течение 3-х ч, постфиксируют 1 %-ным раствором четырехокиси осмия на 75 мМ какодилатном буфере в течение 3-х ч, обезвоживают в возрастающем ряду ацетона С70-100%), заливают в смесь эпон-аралдит, полимеризуют течение 48 ч. Ультратонкие срезы получают на ультрамикротоме фирме LkB (Швеция). Материал просматривают в электронных микроскопах ЗНАЛ - 100 СХ,:ЗЕМ -7А(1еое°., Япония) при ускоряющем напряжении 60 кВ. В некоторых фагосомах макрофагов наблюдаются электронно-плотные осадки фосфата свинца. Следовательно, такие структуры представляют собой уже не фагосому, слившуюся с лизосомой, т.е. фаголизосому. Пример2. Тоже, что и пример 1, за исключением того, что (В среду инкубации вводят 4 мМ (3-глицерофосфата. Осадок при просмотре в электронном микроскопе не обнаруживается из-за его недостаточности.

Примерз. То же, что и пример 1, за исключением того, что в среду инкубации вводят 16 мМ fl -глицерофосфата. Осадок при просмотре в электронном микроскопе носит неспецифический характер - общий фон поля темный.

П р и м е р 4. То же, что и при-. |мер 1, за исключением того, что в среду инкубации вводят 1 мМ нитратасвинца. Осадок при просмотре в электронном микроскопе не обнаруживается из-за его недостаточности.

ПримерЗ. Тоже, что и пример 1, за исключением того, что в среду инкубации вводят б мМ нитрата CD-инца. Осадок при просмотре в электiронном микроскопе носит неспецифический характекр - общий фон поля темный кроме того, наблюдается рибель клеток из-за токсичности в таких кон-. . центрациях солей свинца.

Предлагаемый способ позволяет проводить исследования на клетках, не подвергающихся предварительно длительному культивированию в системе . in vUroH регистрировать процесс .слияния фагосом не только с вторичными, а с первичными и вторичными лизосомами, а также дает возможность определять фаголизосомальные структуры на субклеточном уровне и значительно сниженной трудоемкостью.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАГОЛИЗОСОМАЛЬНЫХ СТРУКТУР КЛЕТКИ дутем инкубации фагоцитов и фагоцитируемых частиц последующего цитохимическо го выявления кислой фосфатаэы и электронного микроскопического исследования внутриклеточных структур, отличающийся Teiyi,. что, с целью повышения чувствительности способа, интактные фагоциты инкубируют в среде, содержащей буферный раствор с рН 7,0-7,2 5-15 мм /) -глицерофосфата и 2-5 мМ нитрата свинца. (Л