ДОНОР ОКСИДА АЗОТА И АКТИВАТОР РАСТВОРИМОЙ ФОРМЫ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ Российский патент 1998 года по МПК C12N9/99 C12N9/88 C07D413/10 

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению бензо[1,2-с: 3,4-с']бис[1,2.5]оксадиазол-1,6-диоксида формулы I

в качестве донора оксида азота и активатора растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ).

Изобретение может быть использовано в биохимии для изучения регуляторных эффектов оксида азота и механизма действия рГЦ и других NO-зависимых ферментов.

Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2. ; гуанозин-5'-трифосфат-пирофосфатлиаза (циклизующая)/ является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3'-5'-циклофосфата (цГМФ)-универсального регулятора внутриклеточного метаболизма [1].

ГЦ существует в двух формах - мембранной и растворимой. В настоящее время установлено, что рГЦ является основной мишенью фармакологического действия наиболее распространенных нитровазодиляторов (нитроглицерина, нитросорбида, нитропруссида натрия) и играет ключевую роль в регуляции таких физиологических процессов, как сокращение и расслабление гладких мышц кровеносных сосудов и агрегация тромбоцитов. Показано, что лечебный эффект вышеуказанных фармпрепаратов связан со стимуляцией активности рГЦ в результате взаимодействия оксида азота, образующегося при их биотрансформации, с атомом железа гема, входящего в состав фермента, и образования комплекса нитрозил-гем.

Существенным недостатком известных вазодилятаторов на основе органических нитратов является возникновение толерантности при их длительном применении. В связи с этим изучение молекулярного механизма регуляции активности рГЦ с помощью новых соединений, способных генерировать NO в живом организме и/или вызывать активацию фермента NO-независимым путем, является перспективным подходом для поиска и создания новых более эффективных антигипертензивных и антиагрегантных фармпрепаратов.

Известны различные N-оксиды и близкие к ним по строению соединения, являющиеся донорами оксида азота и/или его биологически активных форм (восстановленной формы -NO^-/HNO, нитрозотиолов), активаторами рГЦ и оказывающие фармакологическое действие на сердечно-сосудистую систему [2].

Так, известны 3,4-дизамещенные фуроксаны, в частности, 1,2,5-оксадиазол-3,4-динитрил-2-оксид, 3-фенил-1,2,5-оксадиазол-4-нитрил-2-оксид и его изомер общей формулы II

где
R¹=CN;
R²=CN или C₆H₅
или R¹=C₆H₅ и R²=CN,
являющиеся донорами оксида азота и активирующие рГЦ из легких крысы в концентрации 0,5 мМ и в присутствии 5 мМ L-цистеина [3]. Действие данных соединений при более низких концентрациях не изучено.

Наиболее близким к соединению формулы I в ряду трициклических производных N, N'-диоксидов является 3,5-дифенилпиразол-4-он-1,2-диоксид формулы III

где
R¹=R²=C₆H₅, генерирующий оксид азота и активирующий рГЦ [4].

Недостатками данного соединения являются невысокая степень генерации NO и активации рГЦ (в 2,5 раза в концентрации 10 мкМ, см. пример 2).

Известен бензо[1,2-с: 3,4-с'] бис[1,2,5]оксадиазол-1,6-диоксид вышеуказанной формулы I, проявляющий выраженное сосудорасширяющее (вазорелаксантное) действие в условиях in vitro и обладающий высокой гипотензивной активностью, превосходящей аналогичный эффект нитроглицерина в эксперименте in vivo [5].

Биохимические свойства данного соединения (в частности, способность генерировать NO данным соединением и влияние на активность рГЦ) до настоящего времени не изучены.

Целью описываемого изобретения является поиск нового донора оксида азота и активатора рГЦ, обладающего более выраженными биохимическими свойствами.

Указанная цель достигается применением известного бензо[1,2-с:3,4-с']бис[1,2,5] оксадиазол-1,6-диоксида формулы I в качестве донора оксида азота и активатора рГЦ.

Бензо[1,2-с: 3,4-с']бис[1,2,5]оксадиазол-1,6-диоксид формулы I был получен известным способом, основанным на реакции 4-нитро-5-хлорбензофуроксана с азидом натрия в среде водного метанола [5,6]. Показано, что в растворе бензо[1,2-с:3,4-с']бис[1,2.5]оксадиазол-1,6-диоксид формулы I существует в равновесии со своим изомером бензо[1,2-с:3,4-с']бис[1,2,5]оксадиазол-3,6-диоксидом [6].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Генерация оксида азота из бензо[1,2-с:3,4-']бис[1,2,5]оксадиазол-1,6-диоксида формулы I.

Для определения оксида азота использовали известный способ, основанный на реакции оксида азота с кислородом воздуха в водной среде с образованием нитрита, количество которого измеряли по интенсивности окрашивания пробы продуктом реакции азосочетания с помощью спектрофотометра.

Проба конечным объемом 400 мкл содержала 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,4) 1 мМ цистеин, изучаемое соединение в концентрации 0,1 мМ и 0,2% ДМСО. В качестве отрицательного контроля использовался водный раствор ДМСО в концентрации 0,2%, а в качестве положительного контроля 0,1 мМ раствор нитрита натрия, содержащий 0,2% ДМСО. Пробы инкубировали 1 час при 20^oC и добавляли последовательно 50 мкл 3 М раствора ацетата натрия, 300 мкл 0,92% раствора сульфаниловой кислоты в 30% уксусной кислоте и 300 мкл N-нафтилэтилендиамина. Пробы инкубировали 10 минут и измеряли оптическую плотность при длине волны 554 нм на спектрофотометре.

Бензо[1,2-с:3,4-с']бис[1,2,5]оксадиазол-1,6-диоксид формулы I в вышеуказанных условиях генерировал 0,233 моль нитрита на моль соединения (в отсутствие цистеина образования нитрита не происходит). Известный структурный аналог - 3,5-дифенилпиразол-4-он-1,2-диоксид формулы III в вышеуказанных условиях генерировал 0,08 моль нитрита на моль исходного соединения.

Пример 2. Активирующее действие бензо[1,2-с:3,4-с']бис[1,2,5]оксадиазол-1,6-диоксида формулы I на рГЦ.

Препарат рГЦ получали из тромбоцитов человека, выделенных из венозной крови доноров известным способом. Активность фермента определяли по количеству образовавшегося цГМФ иммуноферментным способом с использованием наборов реактивов для количественного определения цГМФ АО "Биоиммуноген" (Россия).

Инкубационная смесь для определения активности (общий объем пробы 150 мкл) приготавливалась при 0-4^oC и содержала 50 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 1 мМ ГТФ, 4 мМ MgCl₂, 4 мМ креатинфосфат, 100 мкг (50 ед/мг) креатинфосфокиназы, 10 мМ теофиллин, ферментный препарат (супернатант 105 000g, 10-20 мкг белка). При определении активирующего действия в среду инкубации вносили изучаемое соединение в виде раствора в водном диметилсульфоксиде (ДМСО). Концентрация соединения в пробе составляла 1 • 10^-5 М, ДМСО - 0,02% об. Контрольная проба показала отсутствие влияния ДМСО в указанной концентрации на базальную активность рГЦ. Пробы инкубировали в водяном термостате при 37^oC в течение 15 минут. Реакцию останавливали перенесением проб на 2 минуты в кипящую водяную баню с последующим охлаждением в ледяной бане. После отделения денатурированного белка центрифугированием (10 минут при 1500 g) в полученном супернатанте определяли количество образовавшегося цГМФ вышеуказанным способом. Определение белка проводили по способу Лоури, в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Эффективность активирующего действия бензо[1,2-с:3,4-с']бис[1,2,5]оксадиазол-1,6-диоксида формулы I в концентрации 1 • 10^-5 М оценивали в сравнении с аналогичным эффектом 3,5-дифенилпиразол-4-он-1,2-диоксида. Степень активации рГЦ в вышеуказанных условиях для соединения данного изобретения составляла 1480% (ср. 250% для известного аналога).

Как вытекает из данных примеров 1 и 2, соединение настоящего изобретения является более эффективным донором оксида азота и оказывает более выраженное активирующее действие на рГЦ, чем его структурный аналог. Таким образом применение бензо[1,2-с:3,4-с']бис[1,2,5]оксадиазол-1,6-диоксида формулы I в биохимии расширяет ассортимент доноров оксида азота и специфических регуляторов активности рГЦ.

Источники информации
1. Murad, F. Regulation of cytosolic guanylyl cyclase by nitric oxide: The NO-cGMP signal transduction system. Adv. Pharmacol. 1994, v.26, p. 19-33.

2. Methods in nitric oxide research. Ed. Feelisch, M., Stamler, J., J. Wiley & Sons, 1996, p.71-118.

3. Ferioli R., Folco G.C. et al. A new class of furoxan derivatives as NO donors: mechanism of action and biological activity. Brit. J. Pharmacol. 1995, v.ll4, p. 816-820.

4. Выложенная заявка ФРГ N 4322545, кл. C 07 D 231/18 1995.

5. Gosh, P.B., Everitt, B.J. Furzanobenzofuroxan, furazanobenzothiadiazole and their N-oxides. New class ofvasodilatory drugs. J. Med. Chem., 1974, v.l7, p.203-206.

6. Bolton, A.J., GripperGray, A.C., Katritzky, A.R. Heterocyclic rearrangements. IV. Furoxano- and furazanobenzofuroxan. J. Chem. Soc., 1965, p. 5958-5964.

Изобретение относится к биохимии, предназначено для изучения регуляторных эффектов оксида азота и механизма действия растворимой формы гуанилатциклазы (рГЦ) и других NO-зависимых ферментов. Сущность изобретения заключается в применении известного бензо[1,2-с:3,4-с^']бис[1,2,5]оксадиаэол-1,6-диоксида формулы I в качестве донора оксида азота и активатора рГЦ. Соединение настоящего изобретения является более эффективным донором оксида азота и оказывает более выраженное активирующее действие на рГЦ, чем его структурный аналог. Таким образом применение бензо[1,2-с:3,4-с^']бис[1,2,5] оксадиазол-1,6-диоксида формулы I в биохимии расширяет ассортимент доноров оксида азота и специфических регуляторов активности рГЦ.

Применение бензо[1,2-c:3,4-c']бис[1,2,5]-оксадиазол-1,6-диоксида формулы I

в качестве донора оксида азота и активатора растворимой формы гуанилатциклазы.