Способ определения диоксиацетона и глицерина при их совместном присутствии в смеси Советский патент 1982 года по МПК G01N21/78 

Изобретение отнсх;ится к аналитической химии и касается способа раз дельного количественного определения диоксиацетона и глицерина в их снесях в культуральных жидкостях. Смесь диоксиацетона и глицерина образуется при получении диоксиацетона микробиологическим путем. Диоксиацетон является важным продуктом для косметической промышлен- . ности, например, в качестве основного компонента диоксиацетон входит в состав кремов для получения искусс венного загара. Известен способ, предназначенный для определения редуг ирующих триоз/ в том числе диоксиацетона, а также гликолевого альдегида и аскорбиновой кислоты с помощью хлористого трифеиилтетразолия и фотометрированием продукта взаимсдействия. Глицерин определяют хроматографированием культуральной жидкости на анионите последующим использованием цветореагента и фотометрироранием ll.. Однако определению диоксиацетона мешают редуцирующие вещества, в том числе редуцирующие сахара, аскорбиновая кислота и др. Определение глицерина является трудоемким процессом. Известен также анзиматический способ определения глицерина, диоксиацетона и глицеральдегида в смесях, заключаюи|ийся в обработке анализируемого раствора ферментами и фотометрированием продуктов реак- ции И . Недостатком способа является то, что ферментные реактивы дорогостояи1и и дефицитны. Известен способ раздельного анализа смеси глицерина с диоксиацетоном путем комбижрованного воздействия гипобромита и периодага калия. Согласно этому способу к одной части анализируемой пробы добавляют раствор бромида калия, 5 мл 0,1 н. H,SO и 15 мл 0,1 н. раствора бромата калия, через 10 мин добавляют 7 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия и оставляет на 15 мин. После этого добавляют 10 мл К и 25 мл 1 н. . Полученный раствор титруют Ojl н. раствором тиосульфата натрия и расчитывают содержание глицерина в смеси. Для определения диоксиацетона берут другую часть анализируемой пробы, добавляют к ней 15 мл 0,05 н раствора периодата калия и выдерживают 2k ч. После этого-к раствору добавляют 25-30 мл kQ% серной кислоты, 2-3 капли хлорида рутения и капель ферринового индикатора Избыток периодата титруют 0,05 н. раствором соли мышьяковистой кислоты и расчитывают общее содержание глицерина и диоксиацетона. Содержание последнего расчитывают по раз ности двух титрований 33 . Недостатками известного метода являются сравнительно низкая чувст вительность, что не позволяет приме нять способ для анализа культуральных жидкостей с небольшим содержани глицерина и диоксиацетона (0,0 мг/ 0,1 мг/мл) и недостаточная точност при анализе диоксиацетона - целевог продукта ферментации, что связано с косвенным определением. Цель изобретения - повышение чув вительности и точности определения. Поставленная цель достигается сог ласно способу определения диоксиацетона и глицерина при их совместном присутствии в смеси, заключающимся в том, что одну часть анализируемой пробы обрабатывают раствором дифенил амина в смеси уксусной и серной кислот, взятых в объемном COOTHOMJCHMM 1:0,11-0,15, с последующим фотометрированием, другую масть анализируемой пробы обрабатывают периодатом калия, последовательно добавляют смесь буферного раствора монохлоруксусной кислоты и 1-2 М раствора моли дата натрия с рН 2,9-3 и 0,5-0,7 М раствора йодистого калия с последую щим фотометрированием. Чувствительность определения диоксиацетона увеличивается за счет того, что проводится прямое определение и взамен малочувствительному реагенту - гипобромиту натрия ;используется цветореагент - дифениламин, который в смеси кислот СН5СООН-Н 50цВ соотношении 1:0,110,15 образует интенсивно окрашенный продукт с максимумом поглощения при 660 нм. Глицерин в среде смеси кислот с дифениламином не взаимодействует и определению диоксиацетона не мешает. Повышение чувствительности определения глицерина достигается тем, что добавлением 1-2 М молибдата натрия при рН 2,9-3 и иодида калия v после окисления периодатом образуется иод, шесть молекул которого пропорциональны одной молекуле глицерина. Таким образом, в 6 раз уменьшается определяемый минимум глицерина. Добавлением 1-2 М молибдата при рН 2,9-3,0 необходимо для связывания избытка Оц в комплекс При больших или меньших указанных рН пределах комплекс разлагается и мешает определению. Меньшее количество молибдата недостаточно для связывания 3 0ц в комплекс, а при более высоких - образуются нежелательные побочные продукты, Иодид калия при рН 2,9-3,0 взаимодействует с продуктом который образуется в результате окисления периодатом глицерина и диоксиацетона. Соответственно одному иону 30. выделяется 3 молекулы глицерина. Так как, из 1 молекулы глицерина образуется 2 иона 3 Oj,то одна молекула глицерина в конечном итоге соответствует 6-ти молекулам Зэ « Точность определения диоксиацетона достигается тем, что вместо косвенного анализа осуществляется прямое определение и при этом его точность мало лияет на погрешность определения глицерина. Точность определения глицерина, несмотря на его косвенное опредеение, сохраняется, так как окисение периодатом осуществляют в 20 кратно разбавленном растворе о сравнению с тем, в котором опеделяется диоксиацетон. Вследствие того в 2-10 раз снижается влияние погрешности определения диоксиацетоа на определение глицерина. Способ осуществляется следующим бразом. Разбавляют анализируемый растор смеси диоксиацетона и глицериа до концентрации диоксиацетона 5 0,1-0,5 мг/мл (раствор А). Разбавляют оаствор А 5 - 20 кратно (раствор Бу. В растворе А определяют диоксиацетон. К раствору А прибавляют дифениламиновый реактив, выдерживают 40 мин в кипящей водяной .бане, после чего фотометрируют при 66О нм в односаитиметровых кварцевых кюветах. Содержание диоксиацето на находят по калибровочному графику, построенному по стандартным рас ворам дисксиацетона с концентрациям 0,05-0,50 мг/мл. Чувствительность анализа 0,05 мг, относительная ошиб ка ±2, 2. В растворе Б определяют общее со держание диоксиацетона и глицерина следующим образом, К раствору Б прибавляют раствор периодата, выдер живают для окисления 2 ч. После этого прибавляют смесь растворов с рН 2,9-3, состоящую из 1-2 М буферн ного раствора монохлоруксусной кисл ты с рН 2,9-3, 1-2 М раствора молиб дата натрия в соотношении 1:0,25 и 0,,7 М калия йодистого. Раствор фотометрируют при 352 нм. По калибро вочному графику, построенному по. стандартным растворам KlOjC концентрациями 0,05-0,50 мг/50 мл, находят количество KlOj,соответствующее общему содержанию диоксиацетона и глицерина в смеси. Согласно известному содержанию диоксиацетона, определенному дифенил аминовым методом, расчитывают соотве ствующее количество Ю05И по разнице с общим К1 0 находят соответствующее содержание глицерина в анализе. Чувствительность анализа 0,01 мг, относительная ошибкаt3,5. Для анализа (в примерах 1-2) используют раствор смеси диоксиацетона и глицерина, содержащей диоксиацетона - 30,0 мг/мл, глицерина 25,5 мг/мл. В примерах используют культуральные жидкости. Пример 1. Соотношение уксусной и серной кислоты 1:0,11, концентрация раствора молибдата натрия 1 М, рН 2,9, концентрация раствора калия йодистого 0,5 И, 0,5 мл анализируемого раствора разбавляют до объема 100 мл (200 кратно)(раствор А), 10 мл раствора А разбавляют до 100 мл (10 кратно) (раствор Б) , 56 Готовят.дифениламиновый реактив следующим образом. В смеси кислот, состоящей из 5 мл ледяной уксусной кислоты и 6 мл концентрированной серной кислоты, растворяют 0,6 г дифениламина, В химических пробирках к 0,5 мл анализируемого раствора А прибавляют мл дифениламинового реактива, выдерживают в кипящей водяной бане, охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность при 600 нм относительно холостого опыта, содержащего вместо анализа 0,5 мл дистиллированной воды D;j 0,220, Соответственно по калибровочному графику находят концентрацию диоксиацетона, С 0,153 мг/мл. В анализируемом растворе концентрация диоксиацетона - ---г- 30,60 мг/мл, в растворе Б концентрация диоксиацетона 0. мг/мл. Относительная ошибка анализа +; 2,0%, чувствительность 0,05 мг/мл. В растворе Б определяют общее содержание диоксиацетона иглицерина, для чего в мерные колбы на 50 мл вносят 2 мл раствора Б, добавляют 2 мл 0,025 М раствора , доводят объем до 20 мл дистиллированной водой и выдерживают 2 часа при комнатной температуре. После этбго добавляют 10 мл смеси 1 М буферного раствора монохлоруксусной кислоты с рН 2,9 и 1М раствора молибдата натрия, доведенной до рН 2,9 и приготовленной в соотноигении 1:0,625. После перемешивания в колбы вносят по 10 мл 0,5 М раствора кйлия модистого, доводят дистиллированной водой .до метки мерных колб и измеряют оптическую плотность в односантиметровых кварцевых кюветах, при 352 нм . относительно холостого опыта )ji 0,375. По калибровочному графику, потроенному аналогично (с учетом вре ени окисления 15 мин), по стандарт- ым растворам KlOjC концентрациями ,05/0,50 мг/50 мл, находят соотетствующую концентрацию С2 0,19+мг/ 0 мл. Расчитывают концентрацию 0j мг/50 мл, соответствующую содеранию диоксиацетона 0,0153 мг/мл в 7 2 млраствора Б; 2,376-0,0153-2 в 0,0727 мг/мл, где 2,376 - количес во ЮОз/роответствующее 1 мг диоксиацетона, мг. По разнице с общей концентрацией К70д находят количество КЗО..,соответ ствующее содержанию глицерина в 2 м раствора Б: 0, - 0,0727 0,121 50 мл. Содержание глицерина в растворе & Ojy50.121 „ ,.- , -bftJ.. 0,0130 мг/мл, где 0,215 - количество глицерина-, с ответсвующее 1 мг КЗО, Содержание глице| 1на в анализируемом растворе 0 012Q:lQOjlOD 0,5-10 « 26,0 мг/мл. Относительная ошибка анализа 1,96%, чувствительность 0,01 мг/мл. П р и м е р 2. Соотношение уксус ной и серной кислоты 1:0,13 концен рация раствора молибдата натрия 1,5 рН 3,0, концентрация раствора калия йодистого 0,6 Но Дифениламиновый реактив: в смеси кислот, состоящей из 5 мл ледяной . уксусной кислоты и 7,1 мл серной кислоты, растворяют 0,6 г дифениламина. Ход работы и расчетов ана; огичек примеру 1. В растворе А определяют диоксиац тон. Найдено: D/j 0,223 С 0, 153мг/ Концентрация диоксиацетона в ана лизируемом растворе Од152 12У 4 0,5 30,60 мг/мл. Относительная ошибка анализа ±2,0%, чувствительность 0,05 мг/мл. В растворе Б определяют общее содержание диоксиацетона и глицерина. (Ход анализа аналогичен примеру 1). При этом используют 1 ,5 М молибдат натрия рН 3,0 концентрация калия йодистого 0,6 М. Найдено Da 0,370, 0 cO,l89 мг КЗОз/50 мл. Диоксиацетону соответствуют 2,376-0,0153-2 0,0727 мг К305/50 Глицерину соответствуют 0,1890-0,0727 0,1163 мг К305/50 мл. Содержание глицерина в растворе Б 0 21210 1163 мг/мл, а в анализируемом растворе .О.Ш5:100 10Л 25,03 мг/мл. 5 Относительная ошибка анализа t. ,8Ц%, чувствительность 0,01 мг/Mrt. П р и м ер 3. Соотношение уксусной кислоты и серной 1 г 0,15, концентрация раствора молибдата натрия 2,0 М, pft3,1 концентрация раствора калия йодистого 0,7 М. Дифениламиновый реактив: в кислот, состоящей из 5 мл ледяной уксусной кислоты и 8,2 мл концентрированной серной кислоты, растворяют 0,6 г дифениламина. Ход работы с расчетом аналоги.чен примеру 1. В растворе А определяют диоксиацетон. Найдено: 0 0,219, 0,152 мг/мл. В анализируемом растворе концентрация диоксиацетона : , 0,5 30,0 мг/мл, а в растворе Б 0,52-10 0,0152 мг/мл. 100 Относительная ошибка анализа ± 1,33%, чувствительность 0,05 мг/мл. В растворе Б определяют общее содержание глицерина и диоксиацетоиа. Найдено: Dj, 0,3б7, 0,188 мг K30j/50 мл. Диоксиацетону соответствуют 2,Зб70,152-2 0,0722 мг КЗОз/50 мл. Глицерину соответствуют 0,l8800,0722 0,1158 мг KnOj/50 мл. Содержание глицерина в растворе Б 0 215:0 158 0 0,2i мг/мл, а в анализируемом растворе 0 012 -100100 24,90 мг/мл. Относительная ошибка анализа ± 2,35%, чувствительность 0,01 м/мл.. При м е р 4. Определение содержания диоксиацетона и глицерина в культуральной жидкости в начальной стадии ферментации. Соотношение уксусной и серной кислоты 1:0,15, концентрация раствора молибдета натрия.1 М, рН 3,0, концентрация калия йодистого 0,7 М, 1 мл исследуемой жидкости разбавяют до о(5ъема 100 йл (раствор А), мл раствора А.разбавляют до 100 мл (раствор Б). Ход работы и расчетов аналогиен примеру 1. В растворе А определяют диоксиацетон. Найдено D 0,110, С 0,076 мг/мл. В растворе анализируемой жидкос ти концентрация диоксиацетона 0,026-100 , , . 7,6 мг/мл. растворе т 0,0038 мг/мя. О нссительное стандартное откло нение определения диоксиацетона + 2,2%, чувствительность 0,05 мг/м В растворе Б определяют обицее содержание глицерина и диоксиацетона. В мерные колбы на 50 мл вносят 1 мл раствора Б, добавляют реактивы, как указано выше. Найдено D 0,580, €4 0,321 кг K30j/50 мл Диоксиацетону соответствуют 0,2376-0,0038-1 0,009 мг iaq/50 н глицерину соответствуют 0,321 -0,009 0,312 мг K30j/50 мл. Содержание глицерина врастворе Б 0,215-0,312 0,067 мг/мл, а в исследуемой культуральной жидкЬс ти О Об -ЮО-ЮО 13,0 мг/мл. . Стандартное отклонение определения глицерина ± 2,k, чувствительность 0,01 мг/мл. П р и м е р 5. Определение содер жания диоксиацетона и глицерина в культуральной жидкости в конечной стадии ферментации. Соотношение уксусной кислоты и серной - 1:0j11, концентрация раствора молибдата натрия - 2 М, рН 2,9 концентрация калия йодистого 0,6 М 0,5 мл исследуемой жидкости разбавляют до объема 200 мл (раствор А). 5 мл раствора А разбавляют до объема 25 мл (оаствор Б). В растворе А определяют диоксиацетон. Найдено 0, 0,3б2, С, 0,256 мг/мл. В анализируемом растворе концентрация диоксиацетона 102ji мг/мл, в растворе Б 0 25б§ --.. 0,051 мг/мл. Стандартное отклонение определения иоксиацетона 2,2, чувствительность ,05 мг/мг. В растворе Б определяют оЬщее содержание глицерина и диоксиацетона . В мерные колбы на 50 мл вносят т раствора Б, добавляют в-ыше указанные растворы-реакти&ы. Найдено Dj, 0,25, Cj, 0,023 мг КЗОз/50 мл. Диоксиацетону соответствует 0,2376 х X 0,051 1 0,121 мг K30j/50 мл, глицерину соответствует 0,,121 0,100 мг К305/50 мл. Содержание глицерина в растворе Б 0,215-0,100 0,0215 мг/мл, в исследуемой культуральной жидкости 0.0.215-g.00:2,5 . 3 „г/мл. Стандартное отклонение определения глицерина ±3,5, чувствительность 0,01 мг/мл. данные сравнения предлагаемого способа с известным приведены в таблице.

Применение изобретения увеличивает чувствительность определения диоксиацетона в 3 раза, а чувствительность глицерина в kO раз. В предлагаемом способе относительная ошибка определения Диоксиацетона не превышает ±2,2 при различных соотношениях глицерина и

1}90

диоксиацетона в смеси и не зависит от точности определения глицерина.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществить анализ целевого и исходного продукта, установить их количественное соотношение в процессе, например, ферментации, и на их основе регулировать производственный процесс, пронозировать выход целевого продукта, т.е. позволяет управлять процессом ферментации.

Практическая значимость повышения чувствительности заключается в том, что способом можно контролировать все стадии производства диоксиацетона, включая культуральные жидкости, начиная с начальных стадий и до завершения процесса.

Повышение точности определения диоксиацетона позволяет более надежно предвидеть ожидаемый выход целевого продукта, улучшить качество диоксиацетона и усовершенствовать технологию производства в целом.

Формула изобретения

Способ определения диоксиацетона и глицерина при их совместном присутствии в смеси, включающий раздельную обработку анализируемой пробы и использование периодата калия

512

отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения, одну часть анализируемой пробы обрабатывают раствором дифениламина в смеси уксусной и серной кислот, взяtыx в объемном соотношении 1:0,11-0,15 с последующим фотометрированием, другую часть анализируемой пробы обрабатывают периодатом калия, последовательно добавляют смесь буферного раствора монохлоруксусной кислоты и 1-2 М раствора молибда та натрия с рН 2,9-3 и 0,5-0,7 М раствора йодистого калия с последующим фотометрированием

Источники 1информации 1принятые во внимание при экспертизе

- Микробиология, т. 31, вып. 6, с. lOSi-lOSS.

p. 404-414.

3.P.C. Verma Estimation of glycerol and dinydroxy wcetone (dimer) in their mixtures. - Vijnana Paishad anusandhan Patrika. 1971, U, № 1, p. 13-15 (прототип).