Способ количественного определения нукле-Озид-5 -МОНОфОСфАТОВ Советский патент 1981 года по МПК G01N31/16 

(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОЗИД-5 -МОНОФОСФАТОВ

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения нуклеози -5 -монофосфатов, которые имеют боль шое значение в медицине, биохимии и молекулярной биологии. Известен способ количаственного определения нуклеозид-5 -монофосфатов, основанный на способности оснований нуклеиновых кислот поглощать ультрафиолетовые лучи в области 240290 нм l. Недостатком зтого способа является низкая.избирательность, поскольку невозможно определять нуклеоэнд-5 -монофосфаты в присутствии дезокс рибонуклеозид-5-монофосфатов и нукле озид-2(3)-монофосфатов. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо му результату является способ количественного определения нуклеозид-5 -монофосфатов, заключающийся в последовательной обработке анализиру емой пробы раствором периодата иатрия, раствором молибдата натрия при рН среды 2,9-3,1, раствором иодида калия с последующим титрованием полученного раствора тиосульфатом натрия в присутствии крахмала 21, Недостатком этого способа является низкая чувствительность определения, т.е. для проведения анализа требуется 35-40 мг анализируемого вещества. Цель изобретения - повышение чувствительности определения. Поставленная цель достигается тем, что в способе количественного определения нуклеозид-5 -монофосфатов, заключаквдимся в обработке анализируемой пробы раствором периодата натрия, раствором молибдата натрия при рН среды 2,9-3,1 и раствором иодида калия с последующим титрованием полученного раствора тиосульфатом натрия в присутствии крахмала, полученный после обработки анализируемой пробы периодатом натрия нуклеозид-5 -монофосфатдиальдегид обрабатывают метиламином или бутиламином при рН среды 6,5-7,5 и температуре 35-40 С при мольном соотношении нуклеозид-5 -монофосфатдигшьдегид ; периодат натрия ; метиламин или бутиламин, равном 1:10-15:160-800 соответственно. В присутствии первичных алифати-ческих аминов положительный эффект достигается тем, что в результате расщепления нуклеозид-5 -монофосфатдиальдегидов .образуются три дополнительных моль иодата, которые действием избытка иодида калия переводятся в эквивалентное количество иода. В конечном определении это приводит к измерению 24 эквивгшентов титранта на 1 моль определения вместо б эквивалентов в известном способе, что представляет собой повышение чувствительности и экономии анализируемого вещества в 4 раза. Для проведения анализа по предлагаемому способу необходимо 7-10 мг анализируе мого вещества.

Расщепление периодатом в присутствии первичных алифатических аминов протекает следующим образом.

Сперва нуклеозид-5 -монофосфатдиальдегиды реагируют с 1 моль первичного алифатического амина с образованием моноальдимина, который претерпевает внутримолекулярную конденсацию с образованием энамина. Последний образует четвертичное амониевое основание, которое быстро отщепляет фосфат, а после этого гидратация четвертичного аммониевого основания приводит к образованию другого энамина, который образует цикличес- кий эфир с периодатом. Гидролиз этого эфира приводит к образованию диола, который реагирует со вторым молем периодата с образованием карбоната гетероциклического основания, который при гидролизе образует промежуточный диол, реагирующий с третьим молем периодата.

Положительный эффект заключается в повышении чувствительности способа в 4 раза, по сравнению с известным, вследствие образования 4 моль иодата в процессе окисления 1 моль нуклеозид-5 -монофосфата.

Температура среды 35-40°С обеспечивает быстрое и количественное протекание., реакции расщепления нуклеозид -Б-монофосфатдиешьдегидов.При более низких значениях температуры скорость реакции расщепления замедляется - реакция протекает количественно лишь за 4-5 ч. При более высоких температурах заметно возрастает в;еличина поправки расхода титранта в холостом опыте, что нежелательно при осуществлении аналитических определений.

Увеличение значения рН также ускоряет реакцию расщепления нуклеозид; .-5 -монофосфатдиальдегидов периодатом. Оптимален интервал рН 6,5-7,5. Повышение кислотности среды замедляет скорость этой реакции, а понижение кислотности среды выше рН 7,5 приводит к заметному возрастанию величины поправки расхода титранта в холостом. опыте..

Соотношения нуклеозид-5 -монофосфатдиальде.гид} периодат : первичный алифатический амин 1 : 10 - 15 : 160-800 обеспечивают быстрое

и количественное протекание реакции расщепления нуклеозид-5 -монофосфатдиальдегидов. При более низких концентрациях периодата и первичного алифатического амина по существующей методике проведение эксперимента невозможно.

Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем.

Навеску определеяемого нуклеозид-5 -монофосфата, величиной, приолизительно 25 мкмоль, растворяют в дистиллированной воде и окисляют 1015-кратным молярным избытком периодата натрия. Затем в реакционную смесь вводят 160-800-кратное молярное количество первичного алифатического амина, нейтрализованное до рН 6,57,5 и выдерживают в водяной бане при 35-40°С в течение 1-2 ч. По окончании реакции расщепления создают рН 3,0±0,2, замаскируют избыток периодата, а образовавшийся иодат избытком иодида калия превращают в эквивалентное количество иода, которое Находят титрованием стандартным раствором тиосульфата натрия. Параллельно проводят холостой опыт (без навески нуклеозид-5 -монофосфата) ;

Содержание основного вещества нуклеозид-5-монофосфатов вычисляют по формуле

(У - Уд) . N. М

100% (1) 6 п . g

где V - объем стандартного раствора тиосульфата натрия, израс ходованный на титрование в . анализе, мл;

V-, объем стандартного раствора тиосульфата натрия, израсходова1|ный на титрование в холостом опыте, мл

N нормальность стандартного раствора тиосульфата натрия (обычно 0,0250 н.), г-экв/л

М молекулярная масса определя.емого нуклеозид-5-монофосфата;

g навеска определяемого вещества, мг;

число моль периодата, реагип - рующих с 1 моль нуклеозид. -5 -монофосфата (п 1 в известном и п 4 в предлагаемом способах).

Пример 1.. Количественное определение аденозин-5 -монофосфорной кислоты (АМФ). М 347,23; рН 7,5; t . .

В коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 8,68 мг и растворяют в 10 мп дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 15 мп 0,025 М раствора периодата натрия в воде, перемешивгиот содержимое колбы и оставляют .на 10 мин в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют 2 мл 4 М раствора гидрохлорида бутиламина, нейтрализованного до рН 7г5 0,1 М раствором NaOH (контроль рН осуществляют рН-метром) и реакционную смесь 1 ч выдерживают в водяной бане при 40°С. Затем в кол бу вносят 25 мл буферного раствора на 1 М раствора монохлоруксусной кис лоты и NaOH с рН 3,0 и 8 мл 2 М раст вора молибдата натрия и тщательно пе ремешивают ее содержимое. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора ио дида калия, перемешивают содержимое колбы и через 2 мин выделившийся иод титруют 0,0250 н. рас.твором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 2 капли 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V) составляет 24,94 мл. Холостой опыт (без навески определяемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (V) составляет 2,14 мл. По формуле (1) вычисляют содержа ние АМФ. АМФ - (24,94-2,14)-347,23-0,250 8, 68- 4-6 X 100 95,0% Определено 25 мкмоль АМФ с точностью 0,8%. Пример 2. Количественное о ределение цитидин-5-монофосфорной кислоты (ЦМФ) . М 323,20 рН 7, t 35°С. . В коническую колбу емкостью 250 м помещают навеску препарата, равную 7,92 мг и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раст вору прибавляют 10 мл 0,025 М раствора периодата натрия в воде, перемешивают содержимое колбы и оставляют на 15 мин в защищенном от прямо го солнечного света месте. Потом пр бавляют 1 мл 4 М раствора гидрохлор да метиламина, нейтрализованного до рН 7,0 0,1 М раствором NaOH в воде (контроль рН осуществляют рЦ-метром и реакционную смесь 1,5ч выдерживаю в водяной бане при . Затем в кол бу вносят 20 мл буферного раствора из 1 М раствора монохлоруксусной ки лоты и ЫаОН срНЗ,Ои5мл2М раст вора молибдата натрия и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец прибавляют 5 мл 20%-ного раствора иодида калия, перемешивают содержимое колбы и через 1 мин выделившийся иод титруют 0,0250 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрова ния прибавляют 2 капли 0,5%-ного рас вора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V ) составляет 20,20 мл. Холостой опыт (без навески определяемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (V,j) составляет 3,00,мл. По формуле (1) вычисляют содержание ЦМФ. НМЛ (20,20-3, 00)-323, 20-0,0250 .. 7,92-4-6 У-ЮО 79,9% Определено 24,5 мкмоль ЦМФ с точностью 0,6%. Пример 3. Количественное определение уридин-5-монофосфорной кислоты динатриевой соли (УМФ.-НаОН). М 368,15-, рН 6,5; t 37°С. В коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 9,20 мл и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 10 мл 0,025 М раствора периодата натрия в воде, перемешивают содержимое колбы и оставляют на 15 мин .в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют 5 мл 4 М раствора гидрохлорида метиламина, нейтрализованного до рН 6,5 0,1 М раствором NaOH (контроль рН осуществляют рН-метром) и реакционную смесь 2 ч выдерживают в водяной бане при . Затем в колбу вносят 20 мл буферного раствора из 1 М раствора монохлоруксусной кислоты и NaOH срНЗ,1и5мл2М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора иодида калия, перемешивают содержимое колбы и через 3 мин выделившийся иод титруют 0,0250 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 4 капли 0,5%-ного раствора крахмала и продолжаю- титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V ) составляет 20,78 мл. Холостой опыт (без навески определяемого вещества) проводят аналогично. Расход титранта (V,.) составляет 1,44 мл. По формуле (1) вычисляют содержание УМФ-Ма. (20,78-1,44)- 368,15-0,0250 t- У .. У УМФ-Na 9,20-4)ЧОО 80,6% Определено 25 мкмоль УMФ-Na2 с точностью 0,5%. Формула изобретения Способ количественного определения нуклеозид-5 -монофосфатов путем обработки анализируемой пробы раствором периодата натрия, раствором

Аюлибдата натрия при рН среды 2,9-Источники информации,

3,1 и раствором иодида калия с по принятые во внимание при экспертизе следующим титрованием полученного

раствора тиосульфатом натрия в при- I, Ультрамикроанализ нуклеиновых

сутствии крахмала, отличай-кислот. Под ред. Д.П. Кнорре. М.,

« и и с я тем, что с целью повышения Наука, 1973, с. 95-133. чувствительности определения, полу-,

ченный после обработки периодатом нат- 2. Вусев А.И., Захаранс В.Я.,

рия иуклеоэид-5-монофосфатдиальдегидМикстайс У.Я. Определение at-гликольдополнительно обрабашвают метилами-иой группировки в компонентах нукленом или бутиламином при рН среды 6,5- АЛиновых кислот. I I. Новый амплифика7,5 и температуре 35-40 0 при мольномционный метод титриметрического опсоотношении нуклеозид-5 -монофосфат-ределения рибонуклаозидов и нуклеозиддиальдегид : периодат натрия : метил--5-фосфатов. Химико-фармацевтичесамин или бутиламин, равном 1:10 -кий журнал, 1977, 3, с. 128-132

15:160 - 800.(прототип).