Способ определения @ -оксиаминокислот и их @ -замещенных производных Советский патент 1984 года по МПК G01N31/16 

1 Изобретение относится к органическому функциональному анализу, а именно к способам количественного определения ci-оксиаминокислот (серина и треонина) и их Н-замещенных производных (N-ацетил и N-трет -бутоксикарбонил), которые применяются в пептидном синтезе, медицине, биохимии и других отраслях. Известен метод определения -о сиаминокислот, основанный на окислении периодатом ot- -оксиаминной группировки. Окисление проводят 3-10 мин в щелочной среде, затем 60 миН в уксусно-кислой среде,после чего избыток периодата восстанавливают до йодата прибавлением йодида калия в бикарбонатной среде, вьщели шийся при этом йод определяют титро ванием раствором арсенита натрия, Формальдегид, образующийся при окис лении серина, и ацетальдегид, образующийся при окислении треонинаj определяют путем их превращения в соответствующие бисульфитные соедин ния и косвенного йодометрического определения последних цианидным спо собом. Аммиак, образующийся при окислении серина и треонина, опреде ляют путем его перегонки в дистилли рованную воду и последующего опреде ления ацидиметрическим титрованием присутствии метилового красного как индикатора Cl. Недостатками способа являются трудность стехиометрического осуществления реакций, необходимость применения либо арсенита натрия,либ цианида калия, либо использование перегонки для определения аммиака. Кроме того, этот способ неприменим для определения N-замещенных производных; с/, -оксиаминокислот. Известен также способ количестве ного определения cL -оксиаминокислот, основанный на их окислении взятым в избьпке периодатом, с последующим определением образующих при этом альдегидов косвенным поляр графическим способом 2 . Недостатками этого способа являются сложность проведения определен (необходимо точно соблюдать продолжительность окисления в 1 мин, а также осуществить косвенное определ ние альдегидов), а также сложность и дороговизна аппаратуры. Кроме тог этот способ неприменим для опреде132ления N-замещенных производных d-OKсиаминокислот. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ, основанный на окислении пробы взя тым в избытке периодатом калия. Способ заключается в помещении 0,51,5 мл 0,01%-ного раствора о -оКснаминокислоты или 50-150 мкг ее анализируемого образца в коническую колбу емкостью 50 мл, прибавлении 5 мл 0,02 н. раствора бикарбоната калия, 1 мл 0,014 М раствора периодата калия и вьщерживании смеси в течение 1 мин. Затем п{)оводят титрование амплификационным методом. Для этого к содержимому колбы прибавляют 3,5 мл ацетатного буферного раствора с рН 2,2, 3,5 мл 25%-ного раствора молибдата аммония, прибли-. зительно 25 мг йодида калияj перемешивают 1 мин, после чего титруют стандартизированным 0,002 М раствором тиосульфата натрия с использованием раствора крахмала в качестве индикатора З, Недостатками способа являются сложность проведения определений (необходимо точное соблюдение продолжительности окисления в 1 мин) и получение несколько завышенных результатов, глиоксиловая кислота взаимодействует с периодатом. Кроме того, этот способ не дает достоверных результатов при определении N-замещенных производных d -оксиаминокислот. Цель изобретения - повьш1ение чувствительности способа. Поставленная цель достигается способом, заключающимся в окислении анализируемой пробы раствором пЁриодата щелочного металла в присутствии щелочного агента с последующим титрованием -продуктов окисления амплификационным методом и расчетом содержания анализируемого вещества, при этом в качестве раствора периодата щелочного металла используют 0,025-0,05 М раствор периодата натрия, в качестве щелочного агента - 0,1-1 М раствор гидрооксида натрия и окисление проводят в присутствии рутената калия в течение 60-120 мин при 18-25°С для oi-оксиаминокислот и в течение 3080 мин при 45-55 С для их N-замещенных производных.

В щелочной среде рутенат катализирует быстрое и количественное окисление периодатом формальдегида и ацетальдегида до формиата и ацетата соответственно.

Количество образовавшегося йодата в условиях определения строго эквивалентно количеству имевшихся с -оксиаминокислот или их N-замещенных производных, что придает достоверность получаемым результатам. Кроме того, 1 моль ot -оксиаминокислоты или ее Ы-замещенного производного реагирует с 3 моль периодата с образованием 3 моль йодата,

что эквивалентно 9 моль трийодида, на титрование которого расходуется 18 г-экв тиосульфата натрия, т.е. чувствительность способа повышается в 3 раза.

Предлагаемый способ заключается В следующем.

Навеску определяемой d -оксиаминокислоты или ее N-замещенного производного величиной 2-15 мг (или аликвотнуго часть раствора в дистиллированной воде величиной 5 мл, содержащую такое же количествоопределяемого соединения) растворяют в 3 мл дистиллированной воды, прибавляют 10-20 мл 0,025-0,05 М раствора периодата натрия в воде, 25 мл 0,1-1 М раствора гидрооксида натрия, 0,1 мл 0,01 М раствора рутената кали в 0,1 и. растворе гидроксида натрия и окисляют в течение 60-120 мин при комнатной температуре в случае cL-оксиаминокислот (серина и треонина), в течение 30-50 мин при 45-55°С в случае N-трет -бутоксикарбонилзамещен ных производных ci-оксиаминокислот и в течение 60-80 мин при 45-55°С в случае N-ацетилзамещенных производных ci-оксиаминокислот. Затем в реакционную смесь вводят 25 мл 6 М раствора уксусной кислоты, 10 мл 1 М раствора молибдата натрия или аммония, хорошо перемешивают содержимое стаканчика для титрования, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,025-0,1 н. стандартизированным раствором тиосульфата натрия в присутствии 0,5%-ного водного раствора крахмала как индикатора, прибав ляемого к концу титрования, до исчезновения сине-розовой окраски раствора,Параллельно проводят холостой опыт (без навески Ы -оксиаминокислоты или ее N-замещенного производного) .

Содержание d -оксиаминокислоты или ее N-замещенного производного вычисляют по формуле:

- (Vi-V2)MN

X

.100%,

18-g

де V - объем стандартизированного раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование в анализе, мп;

V - объем стандартизированного раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование в холостом опыте, мл-,

М - молекулярная масса определяемой oi -оксиаминокислоты или ее N-замещенного производного,

N - концентратдия стандартизировя.нного раствора тиосульфата натрия,г-экв/л; g - навеска определяемого соединения , мг.

При снижении температуры окислеия замедляется скорость проходящих еакций, а при ее повышении реакции ускоряются, однако на кривых образования йодата в зависимости от родолжительности окисления не выявяются прямолинейные участки, соответствующие стехиометрическому осуществлению этих реакций, а наблюается нарушение их стехиометрии в торону завьшгения.

То же самое наблюдается и при отклонении от указанных концентраций периодата натрия и гидроксида натрия.

Пример 1. Количественное определение L-cepiraa.

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 4,815 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 10 мл 0,05 М раствора периодата натрия, 25 мл О,1 М раствора гидроксида натрия и 0,1 мл 0,0135 М раствора рутената калия в О,1 н. растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на 120 мин при 18С в. заирпценном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют 25 мл 6М раствора уксусной кислоты, 10 мл

1 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,0446 раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V ) составляет 20, 22 мл.

Холостой опыт (без навески L-серина) проводят аналогично. Расход титаята (V) составляет 2,01 мл.

Содержание L-серина вычисляют по формуле:

(20.22-2,01).105.09-0,0446 ,

X

18-4,815

98,5%.

Определено 4,815 г L-серина с точностью 0,6%.

Пример 2. Количественное определение D,L-тpeoнинa.

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску

X - (1.15-1,38).,0446

X18-3,782 ° 5 Определенй 3,782 мг D,L-TpeoHHHa с точностью 0,9%. . Пример 3. Количественное о ределение D,L-тpeoнинa. В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 4,345 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 20 мл 0,025 М раствора периодата натрия, 25 мл 1 М раствора гидрокси да натрия и О, 1 нп 0,0135 М раствора рутената калия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на 90 мин при в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют 25 мл 6 М раствора

X С16.71-2.02)419.12-0,0446

X18-4,345° °

Определено 4,345 мл D,L-тpeoнина с точностью 0,7%.

Пример 4. Количественное определение N-трет-бутоксикарбонил-Ь-серина.

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску npeпрепатата, равную 3,782 иг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 20 мл 0,025 М раствора периодата

натрия, 25 мл 1 М раствора гидроксида натрия и 0,1 мл 0,0135 М раствора рзрггената калия в 0,1 н. растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на

60 мин при 25 С в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют 25 мл 6 М раствора уксусной кислоты, 10 мл 1 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,0446 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титроваеия прибавляют 0,5 мл 0,5%-ного

раствора Крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой JOKpacKH раствора. Расход титранта составляет 14,15 мл.

Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет 1,38 мл.

По формуле вычисляют содержание D,L-тpeoнинa:

парата, равную 5,480 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 10 мл 0,05 М раствора периодата

натрия, 25 мл 0,2 М раствора гидроксида натрия и 0,1 мл 0,0135 М раствора рутената калия в 0,1 н. уксусной КИСЛОТЫ, 10 мл 1 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,0446 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта составляет 16,71 мл. Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет 2,02 мл. По формуле вьиисляют содержание D,L-TpeoHHHa:

71

растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на 30 мин при 55 С (водяная баня) в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибав ляют 25 МП 6 ti раствора уксусной кислоты, 10 МП 1 М раствора молибдата аммония и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-ного раствооя йодида калия и при перемешивании титруют 0,0258 н. раствором (23,22-5,15) -205, Л 18.-5,480 Определено 5,480 мг N-трет-буток сикарбонил-Ь-серина с точностью 1,2%. Пример 5. Количественное определение Н-трет-бутоксикарбонил-L-серина. В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 14,20 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 20 мл 0,5 М раствора гидроокиси натрия и О,1 мл 0,0135 М раствора рутената калия в 0,1 н. растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на 50 мин при (водяная баня) в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют . (14,22-1,85)20 18 -14,2 Определено 14,20 мг N-трет -буток сикарбонил-Ь-серина с точностью 1,0%. Пример 6. Количественное определение натриевой соли N-ацетил-В,Ь-серина. Опьггная партия № 8 В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску пре парата, равную 6,170 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 10 мл 0,05 М раствора периодата на рия, 25 мл О,1 М раствора гидроксид натрия и 0,1 мл 0,0135 М раствора рутената калия в О,1 н. растворе гидроксида натрия, перемешивают со держимое стаканчика и оставляют на 60 мин при 55°С (водяная баня) в защищенном от прямого солнечного

(14,42-3,30)-171,14-0,0534 18.-6,170

058138

тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине5 розовой окраски раствора. Расход титранта составляет 23,22 мп.

Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет 5,15 мл.

10По формуле вычисляют содержание N-трет -бутоксикарбонил-Ь-серина:

100% 91,5%. 58 100% 97,0%. 5 мл 6 М раствора уксусной кислоты, 10 МП 1 М раствора молибдата аммония и тщательно перемешивают соержимое стаканчики. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора йодиа калия и при перемешивании титуют 0,0982 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать о исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход гйтранта - тавляет 14,22 мл. Холостой опыт прозодят аналогично. Расход титранта составляет 1,85 мл. По формуле вычисляют содержание N-трет -бутоксикарбонил-L-серима: ,0982 100% 97,5%. света месте. Потом прибавляют 25 мл 6 М раствора уксусной кислоты,10 мл 1 М раствора молибдата яатрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика . Наконец, прибав ;тяют 5 мл 20%-ного раствора йодида: калия и при перемешивании титруют О,0534 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавлйгот 0,5 мл 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта составляет 14,42 мл. Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет 3,30 мл. По формуле вычисляют содержание натриевой соли N-aцeтил-D,L-cepинa:

Таким образом, опытная партия № 8 натриевой соли Ы-ацетил-В,Ь серина содержит 91,5% основного вещества (погрешность 1,2%).

Пример 7. Количественное определение натриевой соли N-ацетил-В,Ъ-серина. Опытная партия № 15.

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 12,36 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 10 мл 0,05 М раствора периодата натрия, 25 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия и 0,1 мл 0,0135 М раствора рутената калия в 0,1 и. растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют иа 80 мин при (водная баня),в (16,05-5,55): 171 «:12,36 Таким образом, опытныя партия № 15 натриевой соли N-аЦетил-В|Ь-серина содержит 43,2% основного вещества (погрешность 1,5%). Предлагаемый способ дает достоверные и точные результаты: относительное стандартное отклонение, характеризугощее точность метода 0,5-1,5%.

защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавлярот 25 мл 6 М раствора уксусной кислоты, 10 мл 1 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют 5 мл 20%-иого раствора йодида калия и при перемешиванрш титруют 0,0534 и раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта составляет 16,05 мл.

. Холостой опыт проводят аналогично Расход титранта составляет 5,55 мл. По формуле вычисляют содержание натриевой соли Ы-ацетил-В,Ь-серина: 0,0534 100% 43,2%. Чувствиз«з1ьшзсть способа повьшена в 3 раза. Определению N-адетилпроиэводных oi-оксиаминокиспот предлагаем1з1м способом не мешает присутствие ацетата. Таким образом, предлагаемый способ позволяет просто и эффективно контролировать технологический процесс получения N-замещенных производных 0 -оксиаминокйслот.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ э1-ОКСИАМИНОКИСЛОТ И ИХ N-ЗАМЕЩЕННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ путем окисления анализируемой пробы раствором периодата щелочного металла в присутствии щелочного агента с последующим титрованием продуктов окисления амплификационным методом и расчетом содержания анализируемого вещества, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа,в качестве раствора периодата щелочного металла используют 0,0250,05 М раствор периодата натрия, в качестве щелочного агента - 0,1-1 М раствор гидрооксида натрия и окисление проводят в присутствии рутена(Л та калия в течение 60-120 мин при 18-25 для об -оксиаминокислот и в С течение 30-80 мин при 45-55 С для их N-замещенных производных. S сл 00 со