Способ получения водорастворимой иммобилизованной холинэстеразы Советский патент 1982 года по МПК C12N11/08 

(54) СПОСО ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОЙ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

I

Изобретение относится к получению биологически активных веществ, а именно к способам получения водорастворимых иммобилизованных ферментов, и может быть использовано для получения препаратов, применяемых для проведения кинетических, аналитических определений, и в частности, для количественного измерения концентрации ингибиторов фермента.

Известен способ получения водорастворимых производныхоС-химотрипсина на карбоксилсодержаищх растворимых в воде nojmMepax ( полиакриловой кислоте, карбоксиметилц ллюлозе и поли-о1-глутаминовой кислоте) . В качестве сшивающего агента используется реактив Вудворта, .пре.дставляющий собой Ы-этил-5-фенилизоксозолий-3-сульфонат. Активность иммобилизованного фермента составляет I7-94% от первоначальHof: активности нативного L

Известен также способ получения водорастворимой иммобилизованной холинэстеразы (КФ 3.1.1.8), в котором иммобилизацию фермента проБО дят на полигалактуроновой кислоте, поли-Ь аспарагиновой кислоте или поли-1,аланине, смешанном с поли-L-глутаниновой кислотой, с помощью реактива Вудворта. Полученные водорастворимые препараты ферменtoта имеют активность, составляющую 42-48% от активности нативного фермента. Стабильность препарата не исследована 2.

К недостаткам известного спосо15ба следует отнести необходимость применения специального сшивающего реактива и то, что процесс иммобилизации протекает при низких температурах. Это является нежелатель20ным, так как при последующей работе с таким ферментным препаратом при температуре выше 20с могут проис ходить дополнительные взаимодейстиия остаточного реактива с ферментом.

При HN -юбилиэации по известным способам фермент неполностью связывается и частично ингибируется.

При использовании водорастворимых иммобилизованных ферментов для анализа и особенно в автоматизированных приборах, важным свойств таких ферментов является стабильность их растворов при инкубации при температуре 38-40 0.

Цель изобретения - повьшение активности и стабильности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения водорастворимой иммобилизованной холинэстеразы в качестве полимера используют полидиацетонакриламид в концентрации 0,1-1%, а иммобилизацию проводят при температуре 40-50 С

Иммобилизация фермента на носителе осуществляется за счет образо йания ковалентных связей свободных аминогрупп холинэстеразы с карбониль ными группами водорастворимого полидиацетонакриламида.

Приготовление раствора водорастворимого полимера диацетонакриламида осуществляют путем свободнора икальной полимеризации мономера в водной фазе в присутствии водорастворимого инициатора - персульфата аммония. Для этого в стеклянный реактцв, снаб женный обратным холодильником, мешалкой, термометром, помещают 18 мл дистиллированной воды,2 г диацетонакриламида растворяют в 40 мл дистиллированной воды, 0,01 г персульфата аммония растворяют в 40 мл дистиллированной воды. Растворы ДАЛ и ilA дозируют их в течение 1 ч при 50 С . Необходимую температуру поддерживают с помощью водяной бани с регулируамым подогревом. Температуру повышают до и проводят выдержку в течение 3 .ч.

Полученный раствор полидиацетонакриламида применяют для иммобилизации холинэстеразы.

Пример 1. Берут 0,7 мп расвора полиацетонакриламида, доводят дистиллированной водой до 10 мл. В этот раствор вносят 80 мг холинэстеразы активностью 1 ОЕ, тщательно перемешивая, термостатируют при температуре 40 С в течение 3 ч. Затем охлаждают до комнатной температуры.

Иммобилизация проходит без потери активности. Иммобилизованный фермент сохраняет на 95% свою активност в течение 18 сут при 35-38°С. Неиммобилизованный фермент в таких же условиях на 20% теряет активность в течение 1,5 сут, аза 5 сут - на 50%.

Пример 2. 7 мл полученного раствора полидиацетонакриламида доводят до 10 мл дистиллированной водой и растворяют в нем 800 мг холинзстеразы с активностью 10 Е.

Иммобилизацию проводят при 50 С в течение 1,5 ч.

Иммобилизованный фермент сохраняет свою активность на 100%. В водных растворах при З5с в течение 20 сут наблюдается потеря активности лишь на 5%.

Использование предлагаемого способа иммобилизации позволяет получить водорастворимые препараты колинэстеразы с полньш сохранением первоначалной активности фермента, тогда как активность холинэстеразы, иммобилизованной известш 1м способом, приводит к двухкратному снижению активности.

При хранении иммобилизованного предложенным способом фермента в течение 18-20 сут при 35-38 С активность его снижается только на 5%, тогда как активный фермент при указанной температуре инактивируется на 20 и 50% за 1 и 5 сут, соответственно.

Использование иммобилизованной на полидиацетонакриламиде холинэстеразы при определении концентрации ингибиторов фермента позволит увеличить сроки хранения готовых водных растворов фермента в 5-}О раз, а также даст возможность повысить производительность и эффективность аналитического определения путем применения готовых ампулированных растворов фермента с повыщенной стабильностью при хранении по сравнению с применяемыми сухими препаратами холинэстеразы.

Водные растворы стабилизированной при помощи иммобилизации холинэстеразы могут найти широкое применение в медицине, сельском хозяйстве и дру гих отраслях народного хозяйства при определении физиологической активности веществ - ингибиторов холииэстеразы. Таким образом, реализация изобретения позволяет получить водорастворимьш препараты холинэстеразы с повышенной активностью и стабильностью. Формула изобретения Способ получения в |дорастворимой иммооилизованной холинзстеразы путем путем иммобилизации на растворимых в воде полимерах, отличаю1щийся тем, что, с целью повышения активности и стабильности целевого продукта, в качестве полимера используют полидиацетонакриламид концентрации 0,1-1%, а иммобилизацию проводят при 40-50 С. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В.Березина и др. М., Изд-во МГУ, 1976, т. 1, с. 218-219. 2.То же, т. 2, с. 276(прототип).