Способ получения иммобилизованных ферментов Советский патент 1984 года по МПК C12N11/08 

Изобретение относится к микробиологической и химической промышленности, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение при получении биохимических реактивов, используемых в молекулярной биологии и генной инженерии.

Известен способ получения иммобилизованных ферментов, заключающийся в полимеризации акрильных мономеров в растворе фермента в присутствии глутарового альдегида и инициаторов полимеризации, причем в реакционную смесь добавляют порошкообразный поликарбамид в количестве 5-10% с содержанием аминогрупп 0,3-0,7 миллиэквивалентов на грамм вещества и процесс ведут при комнатной температуре СП ,

Однако указанный способ не обеспечивает достаточно высокой абсолютной и относительной активности и стабильности получаемого продукта (в частности иммобилизованную транс-N-дезоксирибозиллазу получают с . абсолютной активностью не более 30 ед/г и коэффициентом сохранения активности не более 0,1, а после 5 дней хранения активность иммобилизованного фермента не превышает 20%).

Целью изобретения является повышение активности и стабильности иммобилизованного фермента.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе в полимеризационную смесь добавляют диизоцианат винной кислоты в количестве 0,25-0,5%, гексаметилендиамин в количестве 0,25-0,4% и сахарозу в количестве 20-30% от веса полимеризационной смеси и процесс полимеризацик ведут при 5-10 С.

При осуществлении способа глутаровый альдегид кспользугот в количестве 0,5-1S от веса полимерИзационной смеси; а в качестве инициаторов полимеризации - N, М5М,; -тетраметилэтиленднамин и надсернокислый акмоний.

пример 1. Для получения препарата имглобилизоваыяой транс-N-дезоксирибозилазы (КФ 2,4,2,6) приготовляют следующие растворы; 1%-ный раствор фермента в дистилль:рованной воде с активностью 8,000 е/д.акт./мл (за единицу агтивности принимается количество фе) мента-катализирующее превращение 1 нмоль субстрата за 1 мин при 37°С); 50%-ный раствор мономеров в дистиллированной воде, в котором содержится 19 в ее. ч. акрил амидс. и 1 вес.ч, N,N-мeтилeнбиc-aкpклaмида/ 50%-ный раствор сахарозы в дистиллированной воде; 50%-ный раствор мономеров в 50%-ной сахарозе с содержанием 19 вес.ч. акриламида и 1 вес,ч. М,Ы-метиленбис-экриламиRa-f 10%-ный раствор гексаметилендиамина (ГММА) в дистиллированной воде; 10%-ный раствор диизоцианата винной кислоты (ДИЦВК) в дистиллированной воде-, 10%-ный раствор надсернокислого аммония (НСА) в дистиллированной воде; 10%-ный раствор N, N, N, N-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕД) в дистиллированной воде.

В охлаждаемом сосуде смешивают

0,3 мл раствора фермента, 0,3 мл 50%-ного раствора сахарозы 1,5 мл раствора мономеров в 50%-ной сахарозе, 0,12 мл 10%-ного раствора ГМДА, 0,08 мл 25%-ного раствора

глутарового альдегида (ГА) (фирма Мерк, ФРГ), 0,13 мл 13%-ного раствора ДИЦВК, 0,23 мл 10%-ного раствора ТЕМЕД, 0,23 мл 10%-ного раствора НСА. Конечные концентраЦии реагентов в полимеризационной смеси следующие,% г мономеры 25, сахароза 30, ГМДА 0,4, ГА. 0,7, ДРПДВК 0,4, НСА 0,75, ТЕМЕД 0,75, фермент 0,1, Температура полимеризационной смеси не должна превышать +5-10°С.

Полученную смесь тщательно перешивают и выдерживают в течение 30-60 сек до образования геля.Образовавшийся блок геля измельчают

до размера гранул 0,3-0,5 мл и

определяют его активность по общепринятой для данного фермента методике. Получают 4 г препарата с активностью 270 ед.акт./г вл,геля,что

составляет 41% от исходной активности. Полученный гель - фермент выдерживают при 4°С в течение 5 сут в буфере и повторно определяют его активность, которая оказывается

равной 210 ед.акт./г вл. геля., что составляет 78% от исходной активности полученного .геля.

Полученные результаты показывают, что данный состав геля обеспечива- ет достаточную активность и ..стабильность препарата ::ч«у1обилизованной транс-. -деаоксирибозилазы.

П р :; м е р 2, Имм:обилизацию фермента гфоводят так, как это описано в примере 1, с и.спользованием тех жз исходных растворов с изменением количества отдельных реагентов. В табл.1 приведены конечные концентрации компоненто.в полимеризационной смеси к результаты, полученные при определении активности препаратов иммобилизованного фермента.

Таблица 1

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ путем совместной полимеризации акрильных мономеров в растворе фермента в присутствии глутарового альдегида и инициаторов полимеризации,о т л и ч а ю- щ и и с я тем,что, с целью повышения активности и стаби;"1ьности целевых продуктов, в полимеризационную смесь добавляют диизоцианат винной кислоты в количестве 0,25-0,5%, гексвмети- лендиамин в количестве 0,25-0,4% и сахарозу в количестве 20-30% от веса полимеризационной смеси и процесс ведут-при 5-10°С.2.Способ по П.1, отличающийся, тем, что используют глу- таровый альдегид в количестве 0,5-1% от веса полимеризационной смеси.3.Способ по П.1, отличающий с я тем, что в качестве инициаторов полимеризации используютN, N, .N', N-тетраметилэтилендиамин и надсернокислый аммоний.(О(Л

в этих условиях гель не образуется Фермент вымывания из геля.

Пример 3. Иммобилизованный ферментный препарат, полученными аналогично примеру 1, применяется для получения, дезоксиаденозина из аденина и тимидина. Для этого ферментный препарат добавляют в реакционную смесь, содержащую 1,75 нмоль/мл еденина и 8,5 нмоль/мл тимидина в цитрат-фосфатном буфере

Данные табл.2 убедительно показывают стабильность и реакционноспособность полученных препаратов.

Пример 4. Иммобилизацию фосфодизстеразы проводят аналогично примеру 1, применяя в качестве

рН 6,0. Реакцию проводят при постоянном перемешивании при 37°С. После завершения первого цикла использования геля-фермента, его отделяют от реакционной смеси на фильтре, промывают буфером и используют в следующем цикле,

Результаты 16 последовательных циклов описаны в табл.2.

Таблица 2

раствора фермента раствор фосфодиэстеразы из змеиного яда с активностью 3000 ед.акт./мл (за.единицу активности принимается такое количество фермента, которое обеспечивает прирост оптической плотности при Л 400 нм на 0,1 о.е. при гидр лизе Са-бис-пара-нитрофенилфосфата за 30 мин, при . Исходное коли чество фермента 2.400 ед.акт. концентрация остальных компонентов полимеризационной смеси,%: мономеры 25, сахароза 20, ГМДА 25, ГА 0,63,. ДИЦВК 0,24, НСА 0,75, ТЕМЕД 0,75. При этом получается ферментный препарат с активностью 220 ед.акт. вла;жного геля, суммарная активность - 1.230 ед.акт, что составля ет 51% от исходной активности фермента. При хранении в течение 10 дней при иммобилизованный фермент полностью сохраняет свою активность. Пример 5. Иммобилизацию нуклеозидфосфотрансферазы из морко ви проводят по примеру 1, применяя в качестве раствора фермента раств нуклеозидфосфотрансферазы из морко ни с активностью lilOO ед.акт./мл (за единицу активности принимается количество фермента, которое обеспечивает образование 1 мкмоль нуклеотида из нуклеозида и паранитрофенилфосфата за 1 ч при 3°С в растворе 0,05 М натрия уксуснокислого в 0,18 М растворе калия фосфорнокислого рН 5 , 2) . Исходное количество фермента 550 ед.акт., концентрация остальных компонентов полимеризационной смеси,% г мономеры 25, сахароза 20, ГМДА 0,24, ГА 0,63, ДИЦЕК О,24,НСА 0,75, ТЕМЕД 0,75. ПриЭТОМ получается ферментный препарат с активностью 14,7 ед.акт./г влажного геля,суммарная активность 10 ед.акт, что составляет 20% от исходной активности фермента. При хранении в течение 14 дней при 4°С иммобилизованный фермент полностью сохраняет свою активность.