Способ получения иммобилизованной холинэстеразы Советский патент 1988 года по МПК C12N11/14 

со

9д

сл

0д

Изобретение относится к биохиии, биотехнологии и предназначено для получения высокоактивных и термостабильных препаратов иммобилизованной холинэстеразы, которые могут найти применение в устройствах для контроля степени загрязнения воздуха, водоемов и рек ингибиторами холинэстераз, производными карбаминовой кислоты и фосфорорганическими соединениями, широко применяемыми в сельском хозяйстве в качестве пестицидов.

Цель изобретения - увеличение активности иммобилизованной холинэсте- разы и выхода фермента при иммобилизации.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве носителя используют си лохром €-80, модифицированный до хлор ангидридного производного ( 10 моль хлорангидридных групп на 1 г носителя). К носителю добавляют холинэстеразу и перемешивают в тече- ние часа в фосфатном буфере при охлаждении. .Затем препарат пройывают охлажденным раствором 1 М NaCl и водой. Способ позволяет увеличить удельную активность иммобилизованного фер- мента с 32,2% до 80%, от удельной активности исходного ферментного препарата.

Пример 1. Активация карбоксильного производного силохрома С-80.

Актив ацию проводят следующим обра- зон, 3 г силохрома С-80, модифицированного до карбоксильного производного, суспендируют в смеси 15 мл абсолютированного хлороформа, 2 мл хлористого тионила и 0,2 мп диметилформ- амида. Суспензию нагревают до кипения и перемешивают с помощью мешалки 5 ч. Затем смесь фильтруют и промывают 300 мл абсолютного хлороформа на фильтре № 100. Осадок на фильтре освобождают от остатка хлороформа с помощью кипящей водяной бани и водоструйного насоса 1 ч. Носитель содержит 10 моль хлорангидридных групп на 1 г.

Сухой продукт хлорангидрида силохрома С-80 суспендируют в 10 мпО,1 М фосфатного буфера (рН 7,2) и смешивают с 10 МП раствора холинэстеразы (3,6 мг в 1 мл 0,1 М фосфатного буфера) (12 мг белка на 1 г носителя). Смесь перемешивают 1 ч при . По- .лученный продукт промывают на фильт

ре № 100 охлажденными до 200 мп 1 М раствора NaCl и 200 мл ледяной дистиллированной воды. Осадок суспендируют в 10 мл дистиллированной воды и хранят в виде суспензии. Удельная активность - 4,2 ед/мг (80% от исходной). Связывается с носителем 55,5% белка.

Пример 2. Сухой продукт хлор ангидрида силохрома С-80 суспендируют в 10.мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2) и смешивают с 10 нп раствора холинэстеразы (1 мг в 1 мл 0,1 М фосфатного буфера) (3,3 мг белка на 1 г носителя). Смесь перемешивают 30 мин при . Далее продукт обрабатывают, как указано в примере 1.

Предпочтительным является способ иммобилизации, описанный в примере 1, так как этот способ обеспечивает связывание 21 ед. активности фермента на 1 г носителя, тогда как второй способ всего 2 ед. на 1 г носителя. Кроме того, продукт, полученный первым способом, характеризуется значительно, большей устойчивостью.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но добавляют 220 мг белка на 1 г носителя (1140 ед, на 1 г носителя). Активность препарата - 267 ед/г (79 мг белка с удельной активностью 3,5 едУмг).

Активность иммобилизованных препаратов сохраняется неизменной в течение 80 дней. Потери фермента при иммобилизации составляют 40,2%.

Таким образом, предложенньй способ позволяет увеличить удельную активность (с 32,.2 до 80%) и уменьшить потери фермента при иммобилизации с 62,2% до 40,2%.

.

45 Формула изобретения

Способ получения иммобилизованной холинэстеразы, включающий ковалентное связывание холинэстеразы с водоне- растворимым носителем путём инкубации предварительно активированного носителя с ферментом в фосфатном буфере при охлаждении с последующим отмыванием целевого продукта от неспецифически адсорбированного фермента, о т- лич ающийся тем, что, с целью увеличения активности целевого продукта и выхода фермента при иммобилизации, в качестве носителя испо

j1A09656

льзуют силохром C-80, активированный1 гносителя, а инкубацию проводят

до хлорангидрида и содержащий 10 -присоотношении 12-220 мг белка на

- 10 мрль хлорангидридньпс групп на1 гносителя.

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и предназначено для получения высокоактивных и термостабильных препаратов иммобилизованной холинэстеразы. Указанные препараты.иммобилизованной холинэстеразы могут быть использованы в устройствах для контроля степени загрязнения воздуха и т.д. Цель изобретения - увеличение удельной активности целевого продукта и выхода фермента при иммобилизации. Способ заключается в связывании фермента с хлорангидрид- ным производным сштохрома C-80j полученного из карбоксильного производного силохрома С-80 при нагревании последнего с хлористым тионилом в смеси: 2 мл хлористого тионила, 0,2 мл диметилформамида и 15 мл абсолютированного хлороформа. В процессе иммобилизации в течение 1 ч 12-220 мг белка на 1 г носителя с носителем связывается 45% активности, 55,50% белка; емкость носителя 8,6 мг/г; удельная активность препарата иммоби- ттизованной холинэстеразы 27,6 ед./г носителя.При хранении в условиях комнатной температуры активность препарата иммобилизованной холинэстеразы .сохранялась в течение 80 дней. i (Л