Способ получения ферментного препарата,обладающего уреазной активностью Советский патент 1982 года по МПК A61K35/78 

I

11зобретение относится к фармацевтической промышленности и касается технологии получения ферментных препаратов.

Известен способ получения ферментного препарата, обладающего уреазной активностью, путем измельчения семян арбуза сорта Любимец хутора Пятигорский, экстрагирования сырья водой при рН 6,9-7,2 и 18-25°С и очистки полученного экстракта ацетоном с последующим выделением целевого«продукта 11.

Однако известный способ не обеспечивает получение ферментного препарата с высокой уреазной активностью (на 1 г препарата 350- 50 ед. Самнера).

Цель изобретения - расширение сырьевой базы и повышение уреазной активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения ферментного препарата, обладающего уреазной активностью, включающем измельчение семян арбуза, их экстрагирование при рН 6, и температуре 18-25 С, очистку полученного экстракта и выделение целевого продукта, в качестве исходного сырья используют измельченные семена арбуза сорта Огонек вида Cltrullus VUlgares Sohrad, экстрагирование проводят фосфатным буфером при соотношении сырье-экстрагент

10 1:3-1 и очистку полученного экстракта осуществляют насыщенным раствором аммония сульфата, а затем этанолом при соотношении этанол-раствор

1:1,5-1:2,5.

ts

Способ осуществляется следующим образом.

2 кг измельченных на вальцах семян арбуза сорт Огонек загружают в экстрактор и экстрагируют 7 л О,1 Н

20 калий-натриевого фосфатного буфера рН 6,8-7,0 приготовленного на дистиллированной воде, содержащей 10 М ЭДТА (этилендиаминтетранатриевой со390ли уксусной кислоты) и 10 М 1% -мер каптоэтанола в течение 1 ч 50 мин при . После освобождения экстракта от муки центрифугированием при k°С с частотой вращения ротора 3000 об/мин (2600 д) в полученных 5,8 л экстракта проводят первичное осаждение белков насыщенным раствором аммония .сульфата, добавляя последнего 3,87 л. После отстаивания в течение 6 ч образующийся осадок отделяют центрифугированием при 4 С с частотой вращения ротора 3000 об/мин (2бОО д), а к надорадочной жидкости вновь добавляют 1,93 л насыщенного раствора аммония сульфата. Оставляют для отстаивания в течение 10 ч. Затем осадок белка, содержащий активный фермент, растворяют в 200 мл воды, охлаждают до и осаждают этиловым спиртом в соотношении раствор-этиловый спирт 1:2. Оставляют для образования осадка на 2 ч. Затем осадок отделяют цен трифугированием при с частотой вращения ротора 3000 об/мин в течение 10 мин. Насадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают при -kQ С в течение 2 ч и высушивают суб лимацией в глубоком вакууме с температурой на противне +30 С в течение 8 ч. Уреазная активность полученного продукта составляет 1500 ед. Самнера на 1 л препарата или 120 мкмоль мочевины в 1 мин на 1 мг белка. Полученный ферментный препарат представляет собой белый аморфный порошок, растворимый в воде, фосфатном буферном растворе рН 7,0-7,. в табл.1 представлена зависимость уреазной активности от соотношения сырья и экстрагента. Таблица 1 Уреазная активность Соотношение сыв единицах самнера/ рья и экстраген /1 г белка та

1651:5,0 1:,5 190,1

.k.0

250,5

Уреазная активность в ед на 1 г белка самнера

96200

1: 1

190500

1:1,5 В табл.3 представлена зависимость уреазной активности от соотношения этанола и раствора целевого продукта,, Таблица 3

Продолжение табл.3 Соотношение эта Урезная активность в ед на 1 г белка нол - раствор амнера 213000 200600 lyoioo Исследование острой токсичности выделенного целевого продукта при п падании внутрь (на животных) в концентрации 10 г на 1 кг веса показали, что уреаза не вызывает отравления. При попадании на кожу и слизис тые оболочки не вызывает раздражени Предлагаемый способ позволяет получить ферментный препарат, обладающий в раза большей уреазной активностью.

Формула изобретения Способ получения ферментного препарата, обладающего уреазной активностью, путем измельчения семян арбуза, их экстрагирования при рН 6,9 7,0 и температуре 18-25 0, очистки полученного экстракта и выделения целевого продукта, отличающ и и с я тем, что, с целью расширения сырьевой базы и повышения активности целевого продукта, в качестве исходного сырья используют измельченные семена арбуза сорта Огонек вида Cltrullus AilgarIs Schradi экстрагирование проводят фосфатным буфером при соотношении сырье-экстрагент 1:3-1: и очистку полученного экстракта осуществляют насыщенным раствором аммония сульфата, а затем этанолом при соотношении этанол-раст,вор 1:1,5-1:2,5. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 595335, кл. В 61 К 35/78,28.02.78.