Способ определения осмотической резистентности лейкоцитов Советский патент 1982 года по МПК G01N33/96 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в клиниколабораторных гематологических исследованиях.

Известен способ изучения осмотической резистентности лейкоцитов, заключакадийся в инкубации изолированных лейкоцитов в гипоосмолярной среде, содержащей краситель, с последуклцим подсчетом неразрушенных клеток в счетных Кс1мерах 1.

Недостатком указанного способа является качественный характер реакции, длительность анализа (свыше 3ч), значительная трудоемкость (подсчет клеток осуществляется пятикратно в течение 3ч).

Известен также способ количественной регистрации реакции аллергического лейкоцитолиза, заключающийся в автоматической регистрации изменений суммарного электрического сопротивления взвеси изолированных лейкоцитов при инкубации их с аллергеном 2.

Недостатком известного способа является применимость его. лишь для регистрации реакции специфического аллергического лейкоцитолиза без учета уровня неспецифической резистентности лейкоцитов к гипоосмотическому фактору.

Цель изобретения - повышение эффективности и точности определения.

Указанная цель достигается тем, что в способе определения осмотической резистентности лейкоцитов, включающем измерение суммар10ного электрического сопротивления лейкоцитарной взв.еси в инк бационной среде, в качестве инкубационной среды используют гипоосмолярнук)

., смесь, состоящую из 50 мл 1,3-10 5-10 И буферного раствора с рН 6,6 8,0, лейкоцитарную, взвесь вносят в количестве 100.- 250 мкл, после чего полученную среду вносят в конт2Q рольную и опытную кюветы кондукто-, метрической установки, затем в конт- рольную К1овету добавляют 0,15,0,05 мл ингибитора протеолиза и измеряют изменение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарной

25 взвеси в опытной кювете по отношению к контрольной.

В качестве ингибитора протеолнза используют контрикал или тразилол в 30 дозе 1000-6000 Ед. На фиг. 1 изображена осмотическа лейкограмма при граничных значениях .параметров способа; на фиг. 2 :то же, по средним значениям парамет ;ров способа. Пример. Приготовление инкубационной смеси. В пробирку, содержащую 5,0 мл 1,2510М трислимонного буфера, вносят 200 мкл лейковэвеси в аутоплазме. Полученную инкубационную смесь по 2,25 мл вносят в контрольную и опытную кюветы коцдуктометрической установки. Реакция в контрольной пробирке ингибируется добавлением 0,05 мл контрикала. При реакция продолжается 45 мин (табл. i). Обработка графической записи заключается в количественной оценке интенсивности осмотического лизиса лейкоцитов по формуле R - BVq - t-c где в - отклонение пера самопишущего милливольтметра, мм; t - время реакции, мин;У - объем взвеси лейкоцитов в аутоплазме, равный 200 мк q - коэффициент разведения лейко-.взвеси, равный 26; Се - содержание лейкоцитов в 1 мкл лейковзвеси; Щпоказатель интенсивности гипоосмолярного лейколизиса в условных единицах. Поскольку значения V и q являют ся постоянными величинами, то выражение -- представляют в виде коэф фициента значения которого изменяю ся в зависимости от содержания лейкоцитов в 1 мкл лейковзвеси (С( )f а выражение,(1) представляют в вид формулы -f4.. Значения коэффициента k в завис мости от уровня лейкоцитов в 1 мкл лейковзвеси (С) представлены в табл, 1. .О скорости лизиса лейкоцитов в гипоосмолярноЗ среде, т.е. о характере их осмотической резистентности судят также по осмотическим лейко раммам (фиг. 1 и 2), где по оси ординат откладывают процент разрушенных клеток, а по оси абсцисс - , время изменения реакции в минутах. Для этого определяют процент сдвига писчика за равные интервалы времени 40 -9 , 9 -18 , 18-27 , 27 -Зб ,. , принимая максимальное откл нение писчика BZ,S за lOCI %. П р и м е р2. Концентрацию буфе ного раств.ора для работы с серийной кондуктометрической установкой, например Фермент-1, определяют требованием к соблюдению мийимально ро фона, т. е. обеспечением минимального вклада концентрации носителей электрических зарядов буферного раствора в суммарную электропроводность инкубационной смеси в ходе реакции субстрат - фермент. Оптимальные значения концентраций буферных растворов для указанных целей находятся в пределах 10 5,. Концентрация субстрата при кондуктометрических исследованиях лежи в диапазоне . Опытным путем нами установлено, что кинетическая кривая реакции гипоосмолярного лейколизиса сохраняет линейный характер при объеме лейкоцитарной взвеси от 60 мкл до 300 мкл, однако при объеме лейковзвеси 60 - 100 мкл угол наклона кривой слишком мал. Наилучшие результаты реакциигипоосмолярного лейколизиса достигают при объеме лейковзвеси 150 250 мкл (табл. 2). Объем инкубационной смеси в измерительных кюветах (2,25 мл) кондуктометрической установки, например ФермеНт-1, определен емкостью ее кювет (2,5 мл). JJнгибитЬp протеолиза в контрольной кювете (контрикал или тразилол) .используют в концентрации 1000 бООО Ед в объеме 0,05 - 0,15 мл. Пример определения осмотической ре истентности лейкоцитов при граничных значениях параметров приведен л .в табл.. 2. Уровень электропроводности в зма- . чительной мере зависит от температуры, при которой протекает исследуемая реакция. Поэтому все кондук-, тометрические измерения проводят с обязательным и строгим соблюдением постоянства значений температуры в измерительных кюветах. Предлагаемый способ в значительной мере автоматизирован, требует в 4 раза меньших затрат времени, по сравнению с известным качественным j способом обладает более высокой точностью (ошибка кондуктометрического способа не превышает 4 %, тогда как ошибка метода при подсчете лейкоцитов в камере составляет 7 %). Таблица

Продолжение табл. 1

Продолжение . 1

Формула изобретения 1. способ определения осмотической резистентности лейкоцитов|Вклю- Д5 чашций намерение суммарного электрического сопротивления лейкоцитарной Bsaedn в инкубационной среде, о т п и ч а ю-щ н и с я тем, что, с