Способ получения продукта присоединения дипептидного производного и аминокислоты Советский патент 1982 года по МПК C07K5/65 C12P21/02 A61K38/05 C07K5/75 

39 где R ензилоксикарбонил, пара-ме токсибензилоксикарбонил; RJJ - бензил; R -метокси, этоксй-группы; П - 1 или 2 N-замещённую аминодикарбоновую кислоту общей формулы .J S 1 и НОС-(СН2)п-СН-СОН где значения R-f и п указаны выще, подвергают взаимодействиф со сложным эфиром аминокарбоновой кислоты общей формулы НгТ -СЙ-С-Вз (Ш) И, где значения R и Rg указаны выше. При полярном соотношении исходных .соединений формул II. и III 1:1 - 1: :3э75, в водной среде, в присутствии металлопротеазы при рН 5,, температуре 10-90 С. Продукты, полученные в процессе реакции, мало раствор мы а воде и выпадают в осадок. Кроме того, предлагаемый способ позволяет получить оптически активный продукт присоединения дипептида и сложного эфира аминокислоты из рацематов, поскольку реакция образования пептидно связи при этом происходит только на L-изомерах. С другой стороны, сложны эфиры аминокислот, используемые для проведения реакции присоединения с образованием продуктов присоединения могут быть либо, в L-форме, либо в D-форме, либо их смесью. При использовании DL-формы сложно го эфира аминокарбойовой кислоты Lизомер DL-формы сложного эфира амино карбоновой кислоты расходуется в про цессе пептидного синтеза при получении продукта присоединения, остающий ся сложный эфир аминокислоты имеет D-форму.. Если концентрации исходных вещест высоки, процесс проходит с количестве ным выходом. При использовании двух молей DL-формы сложного эфира аминокарбоновой кислоты на 1 моль L-формы N-замещенной моноаминодикарбоновой кислоты получают продукт присоединения, состоящий в основном из LL-дипептидного сложного эфира и сложного 74 эфира D-аминокарбоновой Кислоты. Полученный продукт присоединения может быть легко разделен на два частичных компонента, т. е. на LL-дипептидный эфир и сложный эфир D-аминокислоты. Таким образом, предлагаемый способ может одновременно обеспечить получение дипептидного эфира и оптическое разделение сложного эфира DL-аминокарбоновой кислоты. Отделенную D-форму или обогащенную D-форму сложного эфира аминокислоты можно рацемизовать обычным способом, и полученный продукт использовать в качестве исходного вещества в описываемом способе. При использовании DL-формы N-замещенной моноаминодикарбоновой кислоты и L-формы сложного эфира аминокислоты D-изомер из DL-формы N-зaмel43ннoй моноаминодикарбоновой кислоты, являясь инертным, остается в водной среде, в результате чего может быть получен продукт присоединения LL-дипептидного сложного эфира и сложного эфира L-аминокарбон-эвой кислоты. Соответственно, если D-форму Ы замещенной моноаминодикарбоновой кислоты выделяют из водной среды, то это моксет одновременно обеспечить получение продукта присоединения и оптическое разделение 1-замещенной DL-моноаминодикарбоновой кислоты. Если выделенную N-замещенную D-моноаминодикарбоновую кислоту рацемизировать известным способом, то полученный продукт может быть исп,ользован в качестве исходного вещества. При использовании DL-формы N-замещенной моноаминодикарбоновой кислоты и DLформы сложного эфира аминокарбоновой кислоты из водной среды может быть получена N-замещенная DL-моноаминодикарбоновая кислота, а также продукт присоединения LL-дипептидного сложного эфира и сложного Эфира D-аминокарбоновой кислоты, причём указанный продукт присоединения разделяют на компоненты, как указано выше. Одновременно может быть достигнуто образорание дипептидного сложного эфира и оптическое разделение N-замещенной DL-моноаминодикарбоновой кислоты и сложного эфира DL-аминокарбоновой кислоты. Предлагаемый способ позволяет исключить стадии введения и удаления защитных групп вбоковой цепи, которые считаются неизбежными в известных 59 способах, что соответственно позволя ет предотвратить потерю исходных веществ; а также использовать DL-форму исходных соединений. В обычных спосо бах с использованием фермента D-изрмер 13Ь-формы исходных веществ не нужен в реакции, и хотя он не влияет на ход реакции, но вызывает потерю исходных веществ. Однако D-форму исходных веществ можно с успехом использовать в качестве агента для оса дения пептида с последующим их восстановлением. Таким образом, при осуществлении предлагаемого способа может быть одновременно достигнуто оптическое раз деление N-замещенной DL-аминодикарбо новой кислоты и сложного эфира DLаминокарбоновой кислоты, Продукты присоединения имеют характеристики, которые можно ожидать на основании формулы I. Например, типичный продукт присоединения, полученный реакцией М-бёнзилоксикарбоНИЛ L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина, дает поглощение в инфракрасном диапазоне и спектр ЯМР, указанные ниже. Инфракрасный спектр: 32бО см (колебание растяжения связи N-41) ; 3000-3200 см (коле1)ание растяжения связи С-Н) ; Г/ч О (сложный эфир ); 172U см ( уретан); 1ббО см (1-ое амидное поглощение); 1бЗО см (карбоксилат); lijAOcM (2-е амидное поглои1ение1; и I+SO см ( деформационное колебание); 1390 см (карбоксилат); 1200 и 1290 см (С-О-С колебание растяжения связи и 3-е амидное поглощение); 1050 см (колебание фенила в плоскости); и и 69IJ см (Колебание монозамещенного бензольного кольца вне плоскости). . ЯМР-спектр, 6 :. (1) 2,75 ррп (2Н (2) 3i02 ррт (itH); (3) 3,61 ррп СЗН) 3,7 ррт (ЗН); (А) k,-k,Q ррт (ЗН); (5.) 5,05 ррт (2Н); (6) 5,82 ррт (5Н) (7) 7,3 ррт (15Н). Результаты элементарного анализа продукта присоединения оказались такими же, что и рассчитанные значения для формулы I, где значения R{, R2., Rj и п указаны выше. Когда продукт присоединения обраб тывают сильной кислотой, такой как соляная, и полученный продукт экстра гируют из органического растворителя такого как этилацетат, то из органи-г 7 6 ческого слоя получают кислотное соединение. При обработке продукта присоединения указанным образом получают кислотное соединение с характеристика.ми и свойствами, отвечающими соединению формулы ;НОС-(СНг)п-СН СШ-СНС-Кз 0) в LL-форме, где R, Rg.,, RT, и n имеют те же значения, что и в продукте присоединения. Кислотное соединение, полученное из продукта присоединения при каталитическом восстановлении дает известное соединение - метиловый эфир па ртил-фенил аланина.. Результаты анализа соединений, полученные на основании инфракрасных спектров, спектр ЯМР и элементарного анализа подтверждают структуру соединения формулы I. Полностью .совпадаю - щие. результаты получены также и в случае, когда выбраны соединения с другими значениями R , Rj, Ъ Протеазы, используемые в предлагаемом способе, являются металлопротеазами, имеющими металлический ион в активном центре. Пригодными металлопротеазами являются ферменты, полученные из микроорганизмов, такие как нейтральные протеазы из актиномицета, пролизин, термолизин, коллагеназа, протеаза Crotuliis atrox и т. д. Могут быть использованы также -неочищенные ферменты, такие как термоаз, тациназа-N, проназа и т, д. Чтобы подавить действие эстеразы, содержащейся в неочищенных ферментах, предпочтительно использовать ферментный ингибитор, картофельный ингибитор вместе с неочищенными ферментами. Используют тиольные протеазы, папаин или сериновые протеазы, трипсин, однако они обладают эстеразной активностью. Поэтому, во время проведен1;1я реакции с использованием таких ферментов необходимо принять меры для предотвращения гидролиза сложных эфиров. Пример 1. 1335 мг (5 ммоль) Н-бензилоксикарбонил L-аспарагиновой кислоты и 1078 мг (5 ммоль) хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина помещают в 30 мл колбу и добавляют 20 мл/ВОДЫ до их растворения, рИ доводят до 6 с помощью . аммиачной

791

воды. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, смесь встряхивают при 38-4оС в течение ночи. Выпавший рсадок отфильтровывают и промывают НО мл воды и сушат. Получают 1145 мг тонких игольчатых кристаллов, имеющи Y. пл. (продукт присоедине.:ния метилового эфира N-бензилоксикарбонил L-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1); выход 75,5% в расчете на хлоргидрат метилового эфира-фенилаланина).

После перекристаллизации из смеси растворителей этилацетата и н-гексана физические свойства и результаты ; элементарного анализа продукта следующие: т. пл. 120-124С; (JL) + +7,} (, метанол).

Найдено, %: С 63,15; Н 6,15; N7,00

Саг.Нз HjOg

Рассчитано, %: С 63,24; Н 6,13; N 6,97.

Сняты ИК-спектр и спектр 1Н-ЯМР продукта.

1145 мг полученного продукта растворяют в 40 мл 1 Н. НС и трижды экстрагируют 30 мл этилацетата. Экстракты объединяют и промывают . беря порции по 20 мл (3 раза), и сушат над безводном сульфатом магния. Раствор концентрируют и продукт перекристаллизовывают из н-гексана, получают 640 мг. Физические свойстваи результаты элементарного анализа Продукта следующие: т. пл. 115-125 С; (J) -15,3 ( метанол)

Найдено, %: С 61,52; Н 5,65; 146,57

СааНгАНгОг

Рассчитано, %: С 61,67; Н 5,65; N6,54.

Результаты инфракрасного спектра и ЯМР-спектра дают характеристики, ожидаемые в метиловом сложном эфире

N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпapтил-L-фe7 .нилаланина.

Полученные результаты совпадают с

результатами исследования соединения, полученного при бензилоксикарбонилировании аминогруппы метилового эфира L-acпapтил-L-фeнилaлaнинa.

Метиловый эфир L-фенилаланина выделяют из смеси солянокислой фазы и фракции промывочной воды, отделенной при экстракции из этилацетатной фазы. Подтверждено, что соединение, полученное посредством первой реакции продукт присоединения метилового эфира N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпapтил-L-фенилаланина и метилового эфира L78 ;

фенилаланина. СпектромН-ЯМР подтверждено, что их молярное отношение составляет 1:1.

Пример 2. 133i мг (5 ммоль) Ы-бензилоксикар6онил:-Ь-аспарагиновой кислоты и 1078 мг (5 ммоль) хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина загружают в 30 мл колбу и к смеси добавляют 10 мл воды, до их растворения и рН раствора доводят до 6 с помощью аммиачной воды. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, и смесь непрерывно встряхивают при С в течение ночи. Осадок отфильтровывают, сушат, получают 1504 мг продукта присоединения метилового эфира М-бензилоЛсикар6онил-L-аспартил-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина 0-0 (выход в расчете на хлоргидрат метилового эфира L-фенилаланина, т. пл. 10 }113 0 .

Пример 3. Получение продукта и обработку реакционной массы проводят аналогично примеру 2, но изменяют количество N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина на 53 мг (2 ммоль) и 863 мг (4 ммоль) соответственно, получают 1068 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбoнил-L-acпapтиn-L-фeнилaлaнинa и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход 70,4% в расчете на N-бензилоксикapбoнил-L-acпapaгинoвyЮ кислоту, т. пл. 11б-119 С.

Пример 4. 534 мг (2 ммоль) N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпapaгинoвoй кислоты и 863 мг (4 ммопь) хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина загружают в 30 мл колбу, растворяют в 8 мл воды, рН доводят до 6,2 с помощью -ной аммиачной воды. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, и смесь встряхивают при 38-40 0 в течение ночи. Осадок отфильтровывают, отделяют от раствора и сушат, получают Т099 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонйл-L-acпapтил-L-фeнилaлaнинa и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход 90,5 в расчете на N-бензилокcикapбoнил-L-acпapaгинoвyю кислоту.

Пример 5. 2б7,2 мг (1 ммоль) N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпapaгинoвoй кислоты и 537г6 мг (3 ммоль) метилового эфира L-фенилзланина растворяют в 5 мл буферного раствора Мак-Илвай9 9

на (рН 7,0), Полученный раствор смешивают с 100 мг термоазы .и 100 мг картофельного ингибитора, и смесь встряхивают в течение 20 ч при . Осадок отфильтровывают и промывают водой и сушат, получают 580 нг неочищенного кристаллического продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход .95,5 в расчете на М-бензилоксикарбонил-Ь-аспаргиновую кислоту, т. пл. 123-125 С.

Продукт растворяют в tO мл смеси диметилформамид и вода (1:1), и к раствору добавляют при перемешивании Н-форму сильнокислотной катионообменной смолы, которую затем отделяют и фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Остаток растворяют в диметилформамиде и к раствору добавляют воду, в осадок выпадает 330 мг метилового эфира Ы7бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина, выход 77,0% в расчете на М-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновую кислоту, т. пл. 123125 0.

Пример 6. 2б7,2 мг (1 ммоль) Ы-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 537,6 мг (3 ммоль) метилового эфира L-фенилаланина растворяют в 5 мл буферного раствора Мак-Илвайна. (рН 7,0). Полученный раствор смешивают со 100 мг тациназы N и со 100 мг картофельного ингибитора, , смесь встряхивают в течение 6 ч при . Осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Получают 120 нг неочищенного кристаллического продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1:1) выход 19,7, т. пл. 119-123 С.

Согласно примеру 5 продукт обрабатывают сильнокислотной катионообменной смолы в Н-форме, получают 50 мг метилового эфира Н-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина. выход 11,7%, т. пл. 95-1054.

Пример 7. 1335 мг (5 ммоль) М-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 1078 мг (5 ммоль) метилового сложного эфира L-фёнилаланина загружают в 30 мл колбу, добавляют k ЦП воды, рН полученного раствора доводят до 6,8 с помощью триэтиламиrta, добавляют 20 мг термолизина, смесьвстряхивают hp в тече7-10.

ние 2 дней. Осадок отфильтровывают, промывают kQ мл воды, сушат, получаtoT.475 кг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-1 -аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1), Выход 31,3 в расчете на хлоргидрат метилового эфира L-фенилаланина. После перекристаллизации из смеси этилацетата и н-гексана получают продукт с т. пл. 120-124 С, (i-)J + 7,2|С

1, метанол)

Элементарный анализ Найдено, %: С 63,52; Н 6,22; N 7,Q Рассчитано, %: С 63,2А; Н 6,13; N 6,97

Пример 8. Процесс ведут аналогично примеру 7, но рН доводят . до 5,2, получают 753 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензйлoкcикapбoнил-L-acпapтил-L-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход ,5 в расчете на метиловый эфир L-фенилаланина.

Пример 9. К раствору 133,6 мг (0,5 ммоль) К-бензилок€Икарбонил- -аспарагиновой кислоты и 89,2 мг (0,5 ммоль) метилового эфира L-фенилаланина в 2,5 мл буферного раствора

Мак-Илвайна (рН7,0) с 0,07 мл триэтиламина, имеющему рН 6,7, добавляют 50 мг термоазы и 50 мг картофельного ингибитора, смесь встряхивают при в течение 20 ч. Осадок отфильтровывают, промывают водой, получают 130 мг неочищенного продукта присое динения метилового эфира N-бензилокcикapбoнил-L-acпapтил-L-фeнилaлaнинaи метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход 85,5 в расчете на метиловый эфир L-фенилаланина, т. пл. 115 .

Раствор продукта растворяют в 20 мл смеси из диметилформамида и воды (1:1), обрабатывают сильнокислот

ной катионообменной смолой в Н-форме

согласно примеру 5 получают 75 мг метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-фенилаланина, полный выход 70% в расчете на 50% количества исходного

метилового эфира L-фенилаланина.

Пример 10. Реакцию проводят аналоП чно примеру 9, но используют О , 05 мл N-метилмррфолина вместо 0,07 мл триэтиламина при начальном рН 6,А. Получают 120 мг неочищенного кристаллического продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарoнилгL-acпapтил-L-фeнилaлaнинa и 119 метилового эфира L-фенилаланина (1:1 ыход 78,9 в расчете на метиловый эфир L-фенилаланина, т. пл. llS-IZiC Продукт обрабатывают сильнокислотной катионнообменной смолой в Н-форме согласно примеру 9, получают 70 мг кристаллического метилового эфира N-бенэилоксикарбонил-Ь-фенилаланина. Полный выход 66% в расчете на использование количества исходного метилового эфира L-фенилаланина. Пример 11. Проводят реакцию аналогично примеру t, но реакцию проводит при рН 6,5 при встряхивании в течение 1 ч, получают 920 мг продукта присоединения метилового эфира N-бёнзилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фе нилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход 75,8, Пример 12. 52 мг (2 ммоль) М-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиНовой кислоты и 863 мг (k ммоль) ;хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина растворяют в 2 мл воды, к раствору добавляют 5,5 мг 1н. НаШ до рН 7Полученный pactBop смешивают с 50 мг термолизина и смесь встряхивают при 38-tO C в течение 2 4i Осадок отфильтровывают, высушивают, получа-ют 73 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-acпapтил-L-фeнилaлaнинa и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход 60,. пл.10б-118°С.П р. и м е р 13. мг (2 ммоль) N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпapaгинoвoй кислоты и 863 мг (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина растворяют в 7 мл воды, рН раствора доводят до 6 с помощью аммиачной воды, к.раствору добавляют 100 мг термоазы, смесь встряхивают при 38АО С в течение нЪчи. Осадок отфильтровывают, промывают 70 мл воды, сушат, получают 550 мг продукта присрединения метилового эфира Ы-бензилокcикapбoнил-L-acпapтил-L-фeнилaлaнинa(1:1). Выход 5,3%, т. пл. 113-1164. П р и м е р И. 270 мл (1 ммоль) N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпapaгинoвoй кислоты и мг (2 ммаль) метилового эфира L-фенилаланина растворяют в 4 мл воды, рН раствора доводят до 6 с помощью 7%-ной аммиачной воды. К полученному раствору добавляют 50 мг термоазы, смесь непрерывно встряхивают при в .течение О.ч. Осадок отфильтровывают сушат, получают 177 мг продукта присоедине7 .12 ния метилового эфира N-бёнзилоксикарбонил-L-acnap гил-L-фeнилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход 23,П т. пл. 103-112С. Пример 15. Процесс проводят аналогично примеру Н, но в раствор добавляют дополнительно еще 50 мг картофельного ингибитора. Получают 381 мг того же самого продукта. Выход 62,У, т. пл. 105-117°С. Пример 16. 53 мг (2 ммоль) N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпapaгинoвoй кислоты и 863 мг (k ммоль) хлоргидрата метилового эфира DU-фенилаланина растворяют в 7 мл воды, величину рН доводят до 6,2 с помощью 7%-ной аммиачной воды. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина и встряхивают в течение ночи при . Осадок отфильтровывают, сушат, получают мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-аспартил-фенилаланина и метилового эфира фенилаланина (1:1). Вь1ход 86,1 в расчете на N-бeнзoилкapбoнил-L-acпapгиновую кислоту, т. пл. . , После перекристаллизации из смеси этилацетата и н-гексана получают продукт с т. пл. 127-135 0,14-1 - 6, (С 1, метанол). Найдено, %: С 63,52; Н 6,19; N6,92 aCaaHvNjOg ; Рассчитано, : С 63,24; Н 6,13; N6,97. Методом ЯМР показана тождественность полученного продукта с продуктом присоединения метилового эфира N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпaptил-L-фенилаланина и метилового эфира D-фенилаланина (1:1), т. е. соединение по примеру 1. 800 мг продукта растворяют в 0 мг 1 Н. нес и экстрагируют дихлорметаном, (30 мл X 3) органическую фазу отде- , ляют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом, упаривают, остаток перекристаллизовывают из смеси этил- ,. ацетата и н-гексана, получают мг кристаллическогопродукта, т. п. 12 1324, - 15,3 (С 1 метанол). . Найдено, : С 61,38; Н 5,58; N6,29 СгаИгцы б . Рассчитано, %: С 61,67;.Н 5,б5; N 6,5А. Продукт представляет собой метиловый эфир N-бeнзилoкcикapбoнил-L-acпapгил-L-фeнилaлaнинa.

13:9101

Водную фазу после отделения слой дихлорметана смешивают с бикарбонатом натрия, значение рН доводят до 8,7 продукт трижды экстрагируют 30 мл хлористого метилена. Экстракт 5 сушат над безводным сульфатом-магния, в экстракт подают газообразный хлористый водород 8 течение 10 мин, затем упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из этилового эфира, по- Ю лучают 29,0 мг хлоргидрата метилового

K-Z-DL-Asp

. А

Ъ-изоме/} L изомер

i ffWf/, N-Z-I,-Ap-L-Phe-№

В реакцион-

ном растВо

%ннь1м N-z-L-Asp -L- Phe- Me-L10б9 MrCt ммоль) N-бензилокси карбонил-БЬ-аспарагиновой кислоты и1 863 мг ( ммоль) хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина растворяют а 2 мл воды, значение рН доводят до 6с помощью аммиачной воды.

Полученный раствор смешивают с 50 .мг термолизина и встряхивают при 38-40 0 в течение 2 ч. Осадок отфильтровывают, промывают 20 мл воды, сушат, получают 787 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилаланинаи метилового эфира L-фенилаланина

N-Z-DL-Asp л

Ъ-изомер 1,-изомер ir-ZОСГПС161ЛСЯ8 реакционном pacmSope растборенным

{роцесс проводят аналогично при-меру 17, но используют метиловый эфир DL-фенилаланина вместо метилового

171

эфира D-фвнилаланина, f, пл. ЙЭ 151°С,Ш - 1В,1 (С 1, метанол); (инфракрасный спектр и-спектр ЯМР совпадают со спектрами L-формы),

Таким образом, полученный продукт продукт присоединения метилового эфира N-бензилокси карбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Dфенилаланина (1:1).

Пример 17. I

L Phe-Me

.1

(1:1) выход 6,8 в расчете на N-бензилоксика|эбонил-Ь-аспарагиновуюкислоту, т. пл. 105-110 0.

После перекристаллизации из смеси этилацетата и н-гексана, получают продукт ст. пл. 121-125 0; ti-1 If « 7,2 (С 1, метанол).

Из оставшейся реакционной смеси выделяют N-бензилоксикарбониласпарагиновую кислоту (в основном в D-форме). i .,.П р и м ер 18. .Используют оба дйуемета

DL - Phe - Me

.

It-изомер й-изопер

эфира L-фейилаланина. Получают 75б м1- продукта присоединения метилового эфира Ы-бензилоксикарбонил-ЬL-Asp-L-Pbe-Me t H-Z-L-A p-L-Phe-Me-D-Phe-Me . остаток 91 -аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира D-фенилаланина (1:1). Выход 62,3% в расчете на N-бвнзилоксикарбонил-| -аспарагиновук кислоту, т. гш. 105-111 С, Продукт перекристаллизовывают из смеси этилацетата и н-гексана, т.пл, - л г л лх г. о л ж Г 1,1 .XV f С- --; ; Ш - 6/5 (0 1, мета126-13 C/-.ratX нол). Из оставшейся реакцконной смеси выделяют Ы- бензилоксикарбонИласпарагиновую кислоту (в основном в D-форме). ;. П р им а р 19. г (20 ммоль) К-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 7,32 г (2 ммоль) метилового эфира L-фенйлаланина растворяют в 70 мл воды. Получают раствор с рН 6,2-6,3. К раствору добавл яют 200 мл термолизина и смесь непрерывно встряхивают в течение k ч при . Осадок отфильтровывают, промывают 70 vs воды, сушат, получают 10,11 г продукта, (т. пл. П7-120 С).: Полученное соединение - продукт . присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланин (1:1), после перекристаллизации из смеси ацетата и Н-гексана, т. пл, 120 12VC, + 7,2 (С 1, метанол). Найдено, % С 63,Т6; Н 6,14; N6,99 C..2Hi7N509 Рассчитано, G 63,24; Нб,13 N 6,97Инфракрасный спектр и спектр ЯМР показали Те же характеристики, которые указаны выше для продукта Присоединения (1:1) метилового эфира N-бёи зилоксикарбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина. После обработки по/мученного Продукта сильной кислотой, экстракции этилацетатом, последующей отгонки органического растворитеяя получают мет тиловый эфир К-бензилЬксикарбонил-Ь аспартил-Ь-фенилаланина. 1,00 г (,б5 ммоль) полученного продукта присоединения метилового эфира Н-бензилоксикарбония-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и сложного эфира L-фенилаланина загружают в 30 мл колбу и добавляют 2 мл воды и 2,0 мл 1н. НС, смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин. Суспензию фильтруют, осадок промы веют 4 мл воды, сушат, получают 0,72 г метилового эфира N-бензилок7сикарбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилаланина. Выход 98,8%. После растворения в этилацетате продукт осаждают н-гексаном, т. пл. 121-12tC, 1 -15,4 (С 1, мёнол). Найдено, % С 61,58; Н 5, N6.56. СггН21,ЫгО Рассчитано, % С 61,б7; Н 5,65; N 6,5. Инфракрасный спектр продукта совпадает со спектром стандартного продуктй. Идентичность продукта подтверждена сравнением водного раствора полученного продукта с водным раствором стандартного соединения методом высокоскоростной жидкостной хроматографии. Чистота, измеренная этим способом, составляет 100%. Устройство для проведения высокоскоростной жидкостной хроматографии и условия ее проведения указаны ниже. Этот способ также использован для оценки чистоты продуктов разложения, продуктов присоединения в примерах, если это не оговорено иначе. То же устройство и те же условия использованы в примерах, если речь идет об этом способе. Устройство для высокоскоростной жидкостной хроматографии (TSK-HLC 801). Колонка: внутренний диаметр 7,5 мм длина 30 см; наполнитель: крахмальный гель, размер частиц 5 мкм (TSKGEL LS 170)V. Элюент: 0, водный раствор ацетата натрия. Скорость потока 0,8 мл/мин перепад давления 20 кг/см j. температура измерения комнатная, детектор - дифференциальный рефрактометр.V Прим ер 20. 1,00 г ,б5 ммоль продукта присоединения метилового эф1фа М-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил 1,-фенилаланина и метилового эфира И-фенилапанина, полученного в примере 19, растворяют в смеси 2 мл воды и 1,32 МП I Н. НС. Реакционную Maqcy перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин и обрабатывают в условиях по примеру 19. Получают 0,70 г продукта в виде тонких призматических кристаллов. Содержание метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-и-фенилаланина96,8% т. пл. 100-.126С. П р и м е р 21.

17910117J8

C-2-L-A5P .Di.-Phe-Me

K-Z-L-Asp-L Phe-Ke

N-Z-L-Asp-L-Flie-Me-D-Phe-Me D-Phe-Me не реагирует с N-Z-L-Asp, в реакции с протеазой связывается с дипептидом и осаждается как аддитивное соединение. 0,53 г (2 ммоль) N-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 0,863 г (k ммоль) хлоргидрата метилового эфира DL-фенилапанина расдворяют в 10 мл воды, рН раствора доводя до 6,0 с помощью аммиачной воды. К раствору добавляют с 50 мг термолизина и смесь встряхивают в течение ночи при . Осадок отфильтровывают, промывают 10 мл воды и сушат, получают 0,90 г кристаллического продукта. Т. пл. 120-126 0. После перекристаллизации из смеси этилацетата и н-гексана, получают продукт с т.пл. 128-13 С - 6,3 (С 1, метанол). Инфракрасный спектр и спектр ЯМР продукта идентичны спектрам присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилапанина и метилового эфира L-фенйлаланина (1:1). Найдено, %: С 63,А2; Н 6,17; N6,95 CbaHvNiOs Рассчитано, %-. С 63,24; Н 6,13; N 6,97. Продукт обрабатывают кислотой, получают метиловый эфир N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метиловый эфир D-фенилаланина в мольном отношении 1:V. Из полученных результатов сделан вывод, что соедийение есть продукт присоединения метилового эфира Ы-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира D-фенилаланина (1:1). Смесь 0,50 т (0,82 ммоль) продукта присоединения с 4 мл воды и 0,26 г лимонной кислоты перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин и обрабатывают в условиях

/ -

Ij-изомер I -изрмер

Т

-f

I

Осадок мера 19, получают 0,35 г кристаллов метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина. Чистота выход 99,3%. Пример 22.. К 0,50 г (0,82 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового .эфира L-фенилаланина, полученного в примере 19, добавляют k мл воды и 0,24 г (1,2 ммоль) п-толуолсульфокислоты моногидрата, обрабатывают смесь по примеру 19, получают 0,33 г кристаллрв метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилаланина. Чистота 100%; выход 93,6%. Пример 23. К смеси 0,45 г (0,82 ммоль) 85% муравьиной кислоты и 8 мл воды добавляют 0,50 г (0,82 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина, полученного в примере 19, смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре, продукт отфильтровывают, промыв.ают 10 мл воды, сушат,, получают 0,312 г белых кристаллов метилового эфира, М-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина. Чистота выход 88,6%. Пример 24. 0,47 г (0,82 ммоль) ледяной уксусной кислоты и 8 мл воды помещают в 30 мл колбу, 0,50 г (0,82 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенила 1анина и метилового эфира L-фенилаланина, смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин, продукт отфильтровывают, промывают 10 мл во-ды, сУшат, получают 0,308 г белых кристаллов метилового эфира М-бенаи-|. 199 локсикарбонил Ь аспартил Ь-фенилаланина. Чистота 100 выход 8792%, Пример 25. 1,00 г (1,65 ммоль) продукта присоединения метилового эфмра N-бензияоксикарбонил-Ь-аспартил Ь-фвнилаланина и метилового эфира L-фенилаланина, полученного в примере 19 Загружают в 30 мл колбу, добавляют 2 мл воды и 2,0 мл 1 , смесь перемешивают при в течение 3 мин, затем обрабатывают способом;, описанным аналогичным а примеру 19, получают 0,35 г кристаллов метилового эфира Н-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланин. Чистота выход 100%. Пример 26. 0,59 г (2 ммоль Н-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспарап ноаой кислоты и 0,860 г (.k ммоль хлоргидрата метилового эфира Ь-фе нилаланина растворяют в 1 н.НаОН, значение рН доводят до 6,0. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, встряхивают в течение ночи . Осадок отфильтровывают, промывают 10 мл воды, сушат, получают 0,928 г кристаллов, имеющих . Результаты подтверждают получение продукта присоединения метилового эфира N-P-метоксибензйлоксикарбонил-Ь аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L фенилаланина (1:.1). После перекристаллизации продукта из смеси этилацетата и н-гексана. . Т.пл. 72-76 С. i-1 + 6,5 (С 1, метанол). Найдено, %-. С б1,85; Н 6, N6,f Cb H NiOio Рассчитано, : С 62,15; Н 6,16; N 6,5:9. Инфракрасный спектр: 3280 см .(колебание растяжения связи N-H); 3020 и 2930 см (колебание растяжения С-Н); 1735 см (сложный эфир С « 0); 1700 см (С О уретан,); (2-ое амидное поглощение); см ( деформационное колебание); 1380 см (карбоксилат); 1210 до см- (колебание растяжения связи G-0-C и 3-е амидное поглощение); 1030 см (колебание фенила в плоскости), и 690, и 810 см колебани фенила вне плоскости). Спектр ЯМР, t : (1) 2,7 ppm (2Н); (2) 3,1 ppm (); (3) 3,6.ppn (ЗЮ; 3.7 ppi (ЗН); (i) 3,8 ppm (3H); (5) 4,0 ppm (IH); (6)it,3ppm (1H); (7) 720 .,8 ppm (IH); (8) 5.0ppm.(2H); (9) 5,65 ppm (3H); (10) 5,65 ppm (IH); (11) b,); и (12) 6,8 до 7,3 ppm (ЙН). Полученные результаты показывают, . что продукт является продуктом присоединения формулы I, где RI, Ra, R, и п означают п-метоксибензилоксикарбонил, бензил, метокси и 1 соответственно. Смесь 0,500 г (0,78 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-Р-метоксибензилоксикарбонил-L-acnap-тил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина, полученного таким образом, с 2 мл воды и 0,9 мл (0,9 ммоль) 1 н.НС перемешивают при 60°С в течение 3 мин. Полученную суспензию отфиль тровывают и промь|вают 6 мл воды, сушат, получают 0,32 г кристаллов. Нижеследующие результаты подверждают, что продукт является сложным эфиром N-P-метокси-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина. Чистота 100, выход 89,1. . Кристаллы растворяют в этилацетатеи продукт осаждают н-гексаном получают соединение с т. пл. 128-130 С, WQ - 15,1 (С 1 метанбл) Найдено, %: С 60,30; Н 5,7t;N5,99 GabHaeNtOe Рассчитано, %: С 60,25; Н 5,72; N6,11. Инфракрасный спектр: 3280 см (растяжение N-H); 2930 и 3020 , (колебание растяжения С-Н); 1735 см (С О сложный ); 1700 см ( уретан); 1б50 см (1-ое амидное поглощение); 1510 до см (2-е амидное поглощение); ЙАО см (деформация С-Н); 1220 до 1270 см (колебание растяжения С-О-С, 3-е амидное поглощение); 1030 и 1050 (колеба ние фенила в плоскости); 690 и 810см (колебание фенила вне плоскости). ЯМР спектр, 5 : (1) 2,8 ррга (2Н); (2) 3,0 ppm (2Ю (3) 3,6 ppm (ЗН); (i) 3,8 ppm (ЗН) (5) 4,5 ppm (1Н); (6),8ppm (IH) (7)6,6ppm (2Н); (8) 6,0 ppm (IH) (9) 6,6ppm (IH); (10) 6,6 ppm (IH) (11) 6,8 до 7,3 ppm C9H). Эти результаты показывают, что конечным продуктом является соединение формулы IV, в KOtQpOM RI, Rj, R и n означает n-иетоксибензилоксикарбонил, бензил, метокси и 1 соответственно. 219 0,2 весовых частей полученного ме тилового эфира N-P-метоксибензилокси -карбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилаланина растворяют в 2 вес.ч. ацетона и к полученному раствору добавляют 1 вес.ч. k Н.НС2, смесь нагревают на водяной бане со слабым противотоком в течение 1,5 ч, до полного разложения для образования раствора, содержащего .в качестве.основных компонентов метиловый сложный эфир L-аспарти -L-фенилаланина, метиловый эфир, L-фе нилаланина и анисовый спирт, причем из указанного раствора получают мети ловый эфир Ь-аспартил-Ь-фенилаланина Пример 27. 0,ii62 г (2 ммоль М-бензилоксикарбонил-Ь-глутаминовой кислоты и 0,86О г (4 ммоль) хлоргидра та метилового эфира L-фенилаланина растворяют в 1 H.NaOH, и.рН доводят до 6,0.. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина и смесь встряхивают при 38-40 С в течение ночи. Осадок-отфильтровывают, промывают 10 мл воды, сушат, получают 0,510 г кристаллов, т. пл. 80-85 0. Следующие результаты подтверждают что получили продукт присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-глутамил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Продукт перекристаллизовывают из смеси этилацетата и н-гексана т. пп 92-97°С. 0,1 (С 1, метанол Найдено, %: С 63,61; Н 6,31;N&,6 CbiHsgNiOs Рассчитано, %: С 63,75; Н 6,32; N 6,76. Инфракрасный спектр: см (колебание растяжения связи N-H); 2950 и 3030 см (колебание растяжени связи С-Н); 1730 и см-(С 0 сложный эфир); 1бЭО (С О урета,н); IbbO см (1-ое амидное поглощение); 1б20 см (карбоксилат); 1530 см (2-ое амидное поглощение); ЙАО см (С-Н деформационное колеба ние); I40b см (карбоксилат); 12АО до 1310 см (С-0-С колебание растяжение и амидное поглощение); 1050 см(колебание фенила в плоскости); 700 и 750 см(колебание фенила вне плоскости). Спектр ЯМР, S : (1) 2,0 ррт 2Н); (2) 2,3 ррт (2Н); (3) 3,0 ррт (iH); (k) 3,6ppm(3H) и 3,7 РЮТ ЗН); (5) 3,8 ррт (1Н); (6) «.З Ррт ПН); (7) i4,8 ррт (1н); (8) 5,0 Ррт (2Н); (9) 722 5,6 ррт (ЗН); (10) 5,8 ррш (1Н); (11) 7,2 ррт (1Н); (12).7Г2 ррт (ЮН); (1Д) 7,3 ррт (5Н) . Эти результаты показывают, что продукт является присоединением формулы I, где R, Rg, Rj, и n означают бензилоксикарбонил, бензил, метокси и 2 соответственно. 0,100 г продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-глутамил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина добавляют при перемешивании 2,3 мл (0,32 ммоль) 0,,. и смесь затем перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин. Полученный белый осадок отфильтровывают и промывают 3 мл во- ды, сушат, получают О,0683 г кристаллов . Следующие результаты подверждают, что продукт представляет метиловый эфир N-бeнзилoкcикapбoнил-L-глyтaмил-L-фенилаланина.,Чистота выход 95,81. Кристаллы растворяют в этилацетате,-и продукт осаедагот-и-гексаном, т. пл. 97-99°С, - 11,0 (С 1, метанол) Найдено, С 62,63; Н 5, N6, Саь Иге NaO Рассчитано, %: С 62,3; Н 5,92; N6,33. Инфракрасный спектр: 3300 см (колебание растяжения N-H); 2930 и 3030 (колебание растяжения С-Н); 1735 см (С О сложный эфир); 1б90 см- (С О уретан); 1650 см (1-ое амидное поглощение); 1530 см (2-ое амидное поглощение); см (колебание деформации С-Н); 1220 до 1280 см (колебание растяжения С-О-С и амидное поглощение); 1050 . (колебание фенила в плоскости) и 695 и 735 см (колебание фенила вне плоскости). Спектр ЯМР, 5 : (1) 2,0 р (2Н); (2) 2,k ррт (2Н); (3) 37 рртТ2Н); (it) 3,7 ррт (ЗН); (5) ,3 ррт (-Ж); (6) k,8 ррт (1Н); (7) 5,1 ррт (2Н); (8) 5,9 ррп (1Н); (9) 7,2 ррт (1Н); (10) 7,2 ррт (5Н); (11) 7,Зррт(5Н); (12) 8,1 ррт (1Н). Эти результаты показывают-, что конечный продукт представляет собой соединение формулы IN, где Ri, Ra, Яз и п означает бензилоксикарбонил, бен- зил, метокси и 2 соответственно. Полученный метиловый эфир N-бензи- лoкcикapбoнил-L-глyтaмил-L-фeнилaлa23 , 9 нина посредством восстановления водо родом превращают в метиловый эфир L глутамил-Ь-фенилаланина, и гидролизом его превращают а N-бензилоксикapбoнил-L-глyтaмил-L-фeнилaпaкинtПример 28. К раствору 0,686 г (3,12 ммоль) хж пидрата метилового эфира L-фенйлаланина в 25мл воды при охлаждении льдом-добавляют 2 H.NaOH водного раствора при переме шивании, при этом доводят рН до , затем не прекращая перемешивания, постепенно добавляют 0,ЗбО г , (1,4 ммоль) ангидрида N-бензилокси арбонил-Ь-аспарагиновой кислоты, рН поддерживают в пределах 7,0-7,5 посредством добавления 2 н.водного раствора NaOH. Смесь перемешивают в te чение 2 ц, к реакционной смеси добав ляют 1 н.НСб водный раствор, чтсбы довести рН до 6. Полученный осадок отфильтровывают, промывают 50 мл воды, сушат, получают О,А16 г продукта присоединения метилового эфира N-бен зилоксикарбонил-Ь-аспартил-фенилалаНина (смесь 86 метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-(О-)-L-фенилаланина и. метилового эфи ра Н-бензилоксикарбрнил-Ь-аспартил-(СуЗ)-Ь-фенилаланина) и метилового эфира L-фенилаланин (1:1) (т. пл. 103-П5°С), В реакционной смеси обра зуется значительное количество метилового эфира i I-бeнзилoкcиkapбoнил-Ь-аспартил-(04)-Ь-фенилаланина, но большая часть соединения остается в фильтрате и в промывочной воде. Полученный продукт присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбо- . нил-Ь-аспартил-( и ОД-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина добавляют к 1,7 мл (0,7 моль 0,4 Н.НС2 при перемешивании, смесь продолжают перемешивать при комнатной температуре в течение 15 мин. По лученный белый осадок отфильтровывают, промывают 3 мл воды, сушат, получают 0,136 г (выход 96,3) кристал лов метилового эсрира N-бензилоксикар бонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина (содержащий 11% Н-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-(С)-Ь-фенилаланина (т.пл. 110-118°С). При м е р 29. В 30 мл колбе 0, г (2 ммоль) N-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 0,918 г (k ммоль) хлоргидрата этилового эфира L-фенилаланина растворяют в 5 мл воды, к раствору добавляют k H.NaCH72значение рН доводят до 6. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, и смесь встряхивают в течение ночи при . ОсаДок отфильтровывают, промывают 30 мл воды, сущат, получают 0,913 г кристаллов, т. пл. 85-90. Продукт тождественен с продуктом . присоединения этилового эфира N-бензи локси ка рбонил-L-аспартил-L-фенилаланина и этилового эфира L-фенилаланина (1:1). После перекристаллизации из смесИ этилацетата и н-гексана получают продукт ст. пл. 93-95 C,ti-lo + 6,0 (С 1, метанол). Найдено, %, С 6,50;.Н 6,56; N 6,63 Рассчитано, %: С 6,23; Н 6,50; N6,61 Инфракрасный спектр: 3300 см (колебание растяжения связи N-H); 2900 до 3050 см (колебание растяжения С-Н); 1710 и см (С О сложный эфир и С О уретан); 1640 см (1-ое амидное поглощение); 1585 см (карбоксилат); 1520 см(2-е амидное поглощение); IjfO см (деформационное колебание С-Н) ; 1380 см(карбоксилат); 1200, 1270:см (колебание растяжения С-О-С и 3-е амидное поглощение); 1055 см(колебание фенила в плоскости); 700, 730 и 750 см (колебание фенила вне плоскости). Спектр ЯМР, в : (1) 1,1 ррп (6Н); (2) 2,7 ррп (2Н); (3) 3,0 ррт (Н); (i.) 4,0 ppm (4Н); (5) 4,1 ppm (IH); (6) 4,5 PiJm(lH); (7) 4,7 ppm (IH); (8) 5,0 ppm (2H); (9) 6,2 ppm (IH);; (10) 6,7 ppm (3H); (11) 7,2 ppm (IH); (12) 7,2 ppm (10H); (13) 7,3 ррт (5H). Эти результаты показь1вают, что продукт является продуктом присоединения формулы I, где R, R, Ri и n означают бензилоксикарбонил, бензил, этокси и 1. , В 30 мл колбе О,125 г (0,197 ммоль) полученного продукта присоединения этилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и этилового эфира L-фенилаланина смешивают 2 мл воды и мл 1н. HCf (0,24 ммоль) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 NMH. Полученную суспензию фильтруют, осадок промывают 5 МП воды, сушат, получают 0,0807 г кристаллов этилового эфира N-бёнзилoкcикapбoниЛ-L-acпapтил-L-фенилаланина. Чистота 100%; выход 92,6%. Кристаллы перекристаллизовывают из смеси этилацетата и н-гексана, получают продукт с т, пл. 128135c,cl - 17,3 (С 1, метаС 62,82; Н 5,96; N6,1 Найдено, %: CabiiieiJiO %: С 62,t3; Н 5,92; Рассчитано N6,33. 3300 CM Инфракрасный спектр: 2900 до 3100 см-; 1730 см , -. 1690 1655 1530 см; . kkO см; 1200-1280 1030 см 690 Спектр ЯМР, б : 1,1 ррп; 2,8 ррт; 3.0ррт; ,1 ррт; +,6 ррт; k,8 ppm; 5.1ppm; 6,0 рри; 7,1 ppm; 7,3 ppn; 9,6 ppm. Пример 30. 5,00 г (16,82 ммоль к-Р-метокси-бензилокси карбонил-Ь-аспарагиновойкислоты и 7,26 г (33,6 ммоль) хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина загружают в 100 мл колбу и добавляют 1н. NaGH, рН раствора 6,0. Полученный раствор смешивают с 2,0 г термолизина и с 0,4 г картофельного ингибитора, смесь встряхивают при в течение 5 ч. Осадок отфильтровывают, промывают 100 мл воды, сушат, получа ют 8,11 г кристаллов, имеющих т.пл. 88-92®С, Выход 75,6% в виде продукта присоединения метилового эфира N-P-меТоксибензилокси карбонил-аспартил-фенилаланина и метилового эфира фенилаланина (1:1). 1осле перекристаллизации из смеси этилацетата и н-гек сана физические характеристики и результаты элементарного анализа, аналогичны продукту присоединения, полу ченного в примере 26. .0,3 г продукта присоединения мети лового эфира N-P-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина раст воряют 3 мл ацетона, к раствору добавляют 2 мл 2,4 н.НСЕ, реакцию проводят при бОС в течение 1 . Реакци онную смесь смешивают с водой, н водным раствором NaHCOj) и циклогексаноном, добавленным в качестве внутреннего стандарта. Методом высокоскоростной жидкостной хроматографии подверждено получение метилового эфи ра А.-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина. Вы.ход 72,7%. Пример 31. 0,3 продукта при соединения метилового эфира N-P-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира L-фёнилаланина, полученного в примере 30, разлагают и анализируют сог-. ласно примеру 30, но вместо ацетона используют диоксан. Выход метилового эфира -L-acпартил-Ь-фенилаланина . Пример 32J Аналогичен при- меру 31 но используют метанол вместо диоксана. Выход метилового эфираА( -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина 63,3%. Пример 33. Аналогичен примеру 31, но используют вместо диоксана NI N-ди мет ил форма МИД. Выход метилового эфира db -Ь-аспартил-Ь-фенил- . аланина 28,1. Пример 3. Аналогичен примеру 31 но в качестве нейтрализующего агента используют k мл диоксана, 1 мл диоксанового раствора 5,3 н,НС и триэтиламин вместо 3 мл диоксана, 2 мл 2fk н.НСЕ и 1,2 Н. водного раствора МаНСОз, соответственно. Выход метилового эфира -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина 98,6%. П р и м е р 35. Аналогичен примеру но реакцию проводят при 90С в течение 20 мин (вместо 60°С в течение 1 ч). Выход метилового эфира -Ь-аспартил-Ь фенилаланина 88,5%. Пример 36. Аналогичен примеру 3, но используют ,5 диоксана и 0,5 мл диоксанового раствора 5,3 н. НС 8 вместо мл и 1 мл вышеуказанных веществ соответственно, а также проводят реакцию при 90 вместо 60С. Выход метилового эфира -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина 84,%. П р и м е р 37. Аналогичен примеру З, но используют 3 мл диоксана и 2 мл диоксанового раствора 5,3 н.НСЕ вместо мл и 1 мл указанных веществ соответственно, а также проводят реакцию при 30°С в течение 120 мин вместо 60°С в течение 1 ч. Выход метилового эфира «L -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина 98,6%. Пример 38. Аналогичен примеру но используют ,5 мл диоксана и 0,5 МП 60% хлорной кислоты вместо 4 мл диоксана и 1 мл диоксанового раствора 5,3 н.НС соответственно. Выход метилового эфира -L-аспартил-L-фенилаланина. П р. и м ё р 39. Аналогичен примеру . но используют 4,85 мл диоксана и 0,15 мл концентрированной серной киcлotы вместо 4 мл диоксана и 1 мл 279 диоксанового раствора 5,3 н.НС. Выход метилоеого эфира -L-аспартил-L-фемилаланина. Пример fO. 0,3 г продукта присоединения метилового эфира N P-метоксибеизилоксикарбонил Ь-аспарти-L-фенилаланина и метилового эфира L-фенилапанина (1:1), полученного в примере 30, растворяют в 2 мл диокса на и добавляют 3 мл трифторуксусной кислоты. Реакцию проводят при в течение 1 ч. Реакционную смесь упа ривают под пониженным давлением, а затем к части этого вещества добавля ют воду, триэтиламин и циклогексанои в качестве внутреннего стандарта, по лученный образец анализируют высокоскоростной жидкостной хроматографией Выход метилового эфира « -L-аспартил -L-фенилаланина 96,А. Пример 41. Смесь 1,000 г продукта присоединения метилового эфира М-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилалаиина и метилового эфира L-фенйлаланина,(1:1), полученного в .примере ЗО, И мл диоксана и 4 мл диоксанового раствора /5,3 н.НСЕ, загружают в 650 мл колбу ;,и.перемешивают при , в течение 1 ч, Диоксан ОТГОНЯЮТ из реакционной смеси при пониженном давлении, добав ляют 6 мл воды и 21}мп диэтилового эфира к оставшемуся маслянистому про дукту, перемешивают, смесь разделяют на две фазы, К водной фазе добавляют 10 мл диэтилового эфира, продукт экс рагируют трижды таким же образом. Эфирные экстракты объединяют, дважды промывают 5 мл 5 -ного водного раствора бикарбоната натрия и сушат над безводным сульфатом магния. Эфир отгоняют при пониженном давлении, полу чают 0,176 г (выход 81,2) неочищенного анисового спирта. Водную фазу нейтрализуют водным раствором гидрата окиси до рН 6, выдерживают примерно при в течение ночи. Полученные кристаллы отфильтровывают и промывают 2 мл воды, сушат, получают 0,316 г (выход 68,5%) неочищенного метилового эфира Ь-аспартил-Ь-фенил аланиНа. Маточник и водные промывки объединяют и подщелачивают водным раствором гидрата окиси натрия до рН, продукт экстрагируют дихлорметаном (3 х 15 мл), объединенные экстракты промывают 5 мл воды, сушат над безводным сульфатом магния. Дихлорметан отгоняют при пониженном 728 давлении, получают 0,23 г (выход 83,4%) неочищенного метилового эфира L-фенилаланина. П р и м е р , 1,189 г((4 ммопь) М-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспарагиноаой кислоты и 1,837 г (8 ммоль) хлоргидрата этилового эфира L-фенйлаланина растворяют в1 н. водном растворе NaCH, рН 6,0. Доводят объем реакционной смеси водой до 15 мл. Полученный раствор смешивают с 100 мг термолизина. Смесь переме,шивают при 38-40 С в течение 7 ч. Осадок отфильтровывают, промывают 30 мл воды, сушат, получают 2,01 г (выход 90,2) продукта присоединения этилового эфира N-P-метрксибензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фанилаланинаи этилового эфира L-фенилаланина (1;1j- ЧТО подтверждено нижеприведенными результатами анализа. Продукт перекристаллизовывают из смеси метанола и эфира. Т. пл. 82ВУ С. CW н- 6,0 (С 1, метанол) Найдено, %: С 63,52; Н 6,57;N6,5 CjsHiibNjOio Рассчитано, %: С бЗ, Н 6,51; N 6,31. Спектры инфракрасного поглощения и ЯМР дают следующие характеристические максимумы. Инфракрасный спектр: 3300 см (колебание растяжения N-H); от 2900 до 3050 см (колебание растяжения С-Н); 1720, 1730 и (С О сложные эфиры и уретан); 1650 см (1-ое амидное поглощение)J от 1510 до см(2-ое амидное поглощение); Н40 см (деформационное колебание С-Н); 1390 см (карбоксилат); от 1220 до 1280 см (С-О-С растяжение и 3-е амидное поглощение) ; 1030 см (деформация фенила в плоскости); и 690, 760 и 810 см (колебание фенила вне плоскости). Спектр ЯМР, : (1) 1,2 pim(6H); (2) 2,7ppm (2Й); (3) 3,1 ppm (Н); (4)3,8 ppm (ЗН); (5) 4,0 ppm (4н); (6) 4,1 ppm (1Н); (7) 4,5 ppm (1Н); (8) 4,7ppm (1Н); (9) 5,0 ppm (1Н); (10,) 5,5 (4Н); (11) 6,1 ppm (1Н); (12) 6,8-7,4 {jprn (14Н). Результаты показывают, что продукт представляет собой присоединение формулы(1}, где R4, R2, Rj и и означает р-метоксибензилоксикарбонил, бензил, этокси и t, соответственно. Повторяют процесс аналогично примеру 34, но используют полученный продукт присоединения вместо продукта присоединения метилового эфира Nrp-метоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и Этилового эфира L-фенилаланина, получают этиловый эфир L-аспартил-Ь-фенилаланина. Выход этилового эфира -L -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина 95,1)%. Пример {З. 1,89 г(. ммоль) М-р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспа рагиновой кислоты и 1,725 г (8 ммоль хяоргидрата метилового эфира DL-фенилаланина загружают в 30 мл колбу и раствбряют при добавлении 1 н. водно го раствора NaCH; рН 6,0. Раствор ра бавляют водой до 15 мл. Полученный раствор смешивают с 0,1 г,термолизина, и смесь перемешивают при 38-ЛО С в течение 50 мин. Осадок отфильтровы вают, промывают 30 мл воды и сушат, получают 2,109 г кристаллов, имеющих т. пл. 119-123 С, затем перекристаллизовывают продукт из смеси этилацетата и н-гексана, высушивают при в течение 7 ч при пониженном давпеНИИ, Подтверждено, что соединение продукт присоединения метилового эфи ра Н-р-метоксибензилоксикарбонил-Ьаспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира 1 -фенилаланина (1:0 пояугидра та. Т. пл. 131-138° :,lJ-lf - i,2 (С 1, метанол). Найдено, %: С б1.50г,Н 6,12; N6, Сз МмНьОто- 1/2 НгР Рассчитано, %: С 61,29; Н 6,23; N 6,50. Спектры инфракрасного поглощения и ЯМР дали те же характеристические особенности, что и в продукте присоединения формулы I, полученном в при мере 26, где R{, R, Ri и h означали р-мет6ксибензилоксикарбонил, бензил, метокси и 1 соответственно, за тем исключением, что поглощения, вызванные протонами воды и групп -NH- и МН| - сдвигались на 4,1 ррт из-за во мущения, обусловленного наличием вод поскольку продукт включал кристаллизационную воду, как указано ниже. Навеску 1,502 г продукта нагревают микроволновым излучением в течение 12 мин в микроволновой печи при частоте 2, ГГц и мощности 1,2 кВт, чтобы высушить образец, вес которого уменьшился до 1,8152 г после облуче ния (потеря при сушке О,,02091 г). Элементарный анализ обулученного образца дал следующие результаты: 1730 Найдено, %: С 62,07; Н 6,17; N6,69 CiiliisNjOw (I) .Рассчитано, С 62,15 Н 6,16; N 6,69. -Спектры инфракрасного поглощения и ЯМР облученного образца дали те же характерные особенности, что и в продукте присоединения формулы I, полученном в примере 26. Навеску 1,0 г облученного образца смешивают с 4 мл воды и 2 мл 1 н. HCt затем полученную смесь перемешивают при в течение 3 мин. Фильтруют, вводят метиловый эфир N-p-метоксикарбонил-Ь-фенилаланина и метиловый эфир D-фенилаланина в молярном отношении 1:1 из твердой фазы и из жидкой фазы, соответственно. Повторяют способ аналогичный примеру 3, но используют 0,3 г полученного продукта присоединения (полугидрат вместо продукта присоединения, полученного в примере 30). Выход метилового эфира -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира D-фенилаланина 95, Пример 4.0,3 продукта присоединения метилового эфира N-p-метоксибензилоксикарбонил-L-acnapтил-Ь-фенилаланина и метиловогб эфира L-фенилаланина (1:1), полученного в примере 30, растворяют в 10 мл раствора 0,3 н.НСВв хлороформе, реакци1д проводят при 60 С в течение 2 ч. Реакционную смесь упаривают при пониженном давлении, к остатку добавляют воду, триэтиламин и циклогексанон в качестве внутреннего стандарта, образец анализируют высокоскоростной жидкостной хроматографией. Выход метилового эфира А- -L ,-аспартил-Ь-фенипаланина 9.3. П р и м е р kS. 53, г N-бензилоксикарбонил-L-acnapaгиновой кислоты и 107,8 г (0,5 моль) хлористоводородного метилового эфира фенилаланина помещают в 1-литровую колбу и добавляют к смеси 300 мл водного раствора едкого натрия для их растворения и для доведения рН до 6,4. Добавляют к реакционной массе 0,3 г термоазы и 0,26 г моногидрата ацетата кальция, полученный раствор оставляютпри 20 С на 218 ч, при этом в осадок выпадает полученное в результате реакции аддитивное соединение метилового эфира М-бензйлоксикарбонил-1-аспарагил-11-фениЛаланина и метилового эфира 0-фенилаланина. Осадок отфильтровывают.

319101

промывают водой, высушивают Скоростной жидкостной хроматографией показывают, что выход продукта 92,7, считая на взятую N-6eнзилoкcикapбoнил-L ; -аспарагиновую кислоту.5

П р им ер 6. Процесс и анализ продукта реакции проводят аналогично примеру 45, но используют 161,8 г (0,75 моль)гхлорист©водор0|дного метиposoго эфира D-фенилаланина, 500 мл раствора едкого натрия, рН 6,7, 1,0 г термоазы и 0,88 г моногидрата ацетата кальция,вместо соответственно 107,8 г, /6,4, 0,3 г и 0,26 г при в те- чение 100 ч, вместо и 21Ь ч. Вы-1 ход 93.3,Считая на взятую N-бензилоксикарбонил-Ь-аспараги«овую кислоту.

Пример 47. Процесс проводят в условиях примера 45, но используют 149,2 Г (0,65 ммоль) метилового эфира DL-фенилаланина гидрохлррида, 50fl мл водного раствора гидроокиси натрия, рН 6,6, 0-,7 г термоаэы и 0,62 г ацетата кальция моногидрата вместо 107,8 г, 300 мл, 6,4, 0,3 г и 0,26 г « соответственно,прй в течение 195 ч вместо 20°С и 218 ч. Выход 90,9% исходя из Н-бензило ссикарбонила-Ь-аспартата.

Г1 р и м е р -48. 0,534 г (2 ммоль) зо N-бензилоксикарбонил-i-аспартата и 0,863 г (4 ммоль) метилового эфира L-фенилаланина гидрохлорида помацают в 30 мл колбу и туда же добавляют

7мл гидроокиси аммония для растворе- 35 ния и доведения рН раствора до 6,0.

8раствор вводят 50 мг термолизина. Раствор перемешивают при в течение 2 ч до выпадения продукта присоединения из метилового эфира N-бемзи- 40 локсикарбонил-Ь-аспартия-Ь-фенипапа Нина и метилового эфира L-фенилапани на. Большое количество в(эдь добавляют

в реакционную смесь, содержащую вы- павшие кристаллы примесного соедине- . 45 ния для их растворения. Полученный в результате этого гомогенный раствор анализируют с помс1и1ью вьгсокоскоростной жидкостной хроматографии; выход примесных соединений 54%.JQ

П р,и мер 49. 0,534 г (2 ммоль) Ы-бензилоксикарбонил-Ь-аспартата и 0,853 г (4 ммоль) метилового эфира DL-фенилаланина гидрохлорида помаца1732 :

ют в 30 мл колбу и туда же добавляют

5мл воды вместе с триэтиламином для растворения и доведения рН до 5,0. В раствор вводят 50 мг термолизина. Раствор перемешивают при в течение 16 ч. Выпавшие кристаллы продукта присоединения, состоящего из метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира D-фенилаланина, отделяют фильтрацией, сушат. Получают 0,836 1 кристаллов, т- пл. 96-113 0.

Пример 50, 0,53 г (2 ммоль) N-бенЗилоксикарбонил-L-аспартата и 0,863 г ( ммоль) метилового эфира DL-фенилалаНина гидрохлорида помещают в 30 мл колбу и туда же добавляют

6мл аммиачной воды для растворения

и доведения рН до 7,2. В раствор вводят 50 мг термолизина и перемешивают при в течение 4,5 ч. Выпавшие кристаллы продукта присоединения, состоящего из метилового эфира N-бензилоксикарбогил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира DL-фенилаланина, отфильтровывают и сушат. Получают 0,630 г кристаллов. Выход 51,8. П р и мер 51 10,7 г CtO ммоль) М-бензилоксикарбонил-Ь-аспартата и 28,0 (130 ммоль) метилового эфира Lфенилаланина тидрохлорида помещают в 260 мл колбу и tyдa же добавляют 10 мл водного раствора гидроокиси матрий для растворения и доведения до 6,6. В раствор вводят 32 мг термолизина. Раствор выдерживают до выпадения кристаллов продукта присоединения. Состоящего из метилового эфира М-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина. Полученные кристаллы отфильтровывают и сушат. Высокоскоростная хр(1атография показала выход 82,5%, исходя из Ы-бензилоксикарбонил-L-аспартата.

П р и м а р 52. Процесс проводят в условиях примера 9, но используют 15 мл аммиачной воды вместо воды и трцэтиламина, рН раствора доводят до 6,0 вместо 5,0. Получают 0,800 г примесных соединений. Выход 65,8%.

Изобретение иллюстрируется табл. 1 и 2.

33

: 3

910117 Таблица . 39910П Формула изобретения Способ получения продуктов присое- . it 1 Rj-C-CH-HHj-HOC-(CHi) где R - бен илоксикарбонил, п-ме токсибензилоксикарбонил Ri-бензил; Rj - метокси, этокси-группы; п 1 или 2,. «$ отличающийся тем, что N-замещенную аминодикарбоновую кислоту общей формулы RJ п « л20 ЛИ V II I И HOC-fCHjU-CH--СОН где значения R и п указаны выше, прдвергают взаимодействию со сложнымj. эфиром аминокарбоновой кислоты общей формулы III динения дипептидного производного и аминокислоты общей формулы I 7 п ° n-CH-C-lM-ai-C-Rj i О П iHiK-CH-C-Kj , где значения Кг и Кь указаны выше, при молярном соотношении соединений формулы II и III 1:1 - , в водной среде, в присутствии металлопротеазы при рН Ь,0-7,2, температуре in -tin ®г Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Josef S. Fnifon Advances in Protein chemistry, Academic Press, Jnc, New Jork, Н. Y. ISjS, vol. 5, c. 33.