Способ получения октапептида Советский патент 1985 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 C07K14/62 

Jiib Изобретение относится к усовершенствованному способу нолучения октапептида формулы 1 I-GE Phe-Pht-T rCft -ТЬг -P..(fcoc)-Th(6i) являющегося по своей аминокислотной последовательнорти фрагментом 2330 В-цепи инсулина человека и применяемого в качестве :1 ррмежуточного соединения при поЛУчёнии инсулина человека. В пептидной химии широко используют при доххтроении пептидной цепи конденсацию фрагментов с защищенными функциональными групп ми, не принимакндими участия в конденсации. Известен способ получения октапептида формулы 1, заключающийся в синтезе двух пептидных фрагментов г-01у-РЬе. РНе-Туг(Би )-ThrOH и HPro-Lys{Boc)-Thr (Bu)OBu 1 23 4 0 и последующей их конденсации в молекулу октапептида, т.е. по схеме |(1-3)+(4-5)/+(6-8).1-8 (см. схему I). Недостатки известного способа низкий выход целевого продукта (-24 %), его невысокая оптическая чистота (,.- 37,7), последнее делает получаемый известным способом октапептид малопригодным для- превращения в инсулин человека. Целью изобретения является повышение выхода октапептида и увеличение его оптической чистоты. Постав-аенная цель достигается описьшаемым способом получения октапептида формулы 1, заключающимся в конденсации двух исходных фрагментов Z-GtijPht-PheOH и H-Y(6«)Thr-PfO-L.j4{ftoc)-Thf Сбитое. 1. Схема 1 (известный способ)

Способ получения октапептида формулы Z-Gty-p«,(i-Phe-T,jrCb)-Thf-P|.o-L.,s(-BeeJ-Th(e4)oei путем фрагментной конденсации, о тличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и оптической чистоты целевого соединения, при конденсации в качестве исходных фрагментов используют 2.-Gdij-Phe.-Phe.OH и Н -Т f

0-П

Boc 0-П Boc - OH H

0-П вц

Boc

0-П 1 - ОН H - OMe

OH H t

оме

92%

,ey l 00%-OMe OH H УЛ

Zt

52% /

У1 Z

t Bu

П Z

Примеч ание. П- полимерный носитель.

УП

УПа

OBu

OH H

Отличительным признаком описываемого способа является использование в качестве промежуточных соединений фрагментов (1-3) и(4-8), т.е. прове .дение синтеза по схеме (1-3)+/(4-5)+ (6-8)/.

Описьюаемый способ позволяет увеличить выход на стадии конденсации.

1 2 3 4

Gly Phe Phe Туг ВоеОН Н--О -nz-- ОН И ОМе t

0-П1/Я.

Вое 0-n ./1Уа

-ОН Н1, Получение Н-бензйлоксикарбоиилглицилфенилаланилфенилаланина (П).

Перемешивают в течение 44 ч при мягком кипячении смесь 10,6 г (40,0 ммоль) N-трет-бутилоксикарбог. нилфенилаланина, 20,0 г хлорметилированного сополимера стирола с 1 % дивинилбензола (содержание хлора 40,0 ммоль) и 5,04 мл (36,0 ммоль)

фрагментов с 53 до 84 % с увеличением выхода целевого продукта до 46 % (почти вдвое).

5 При этом повышается оптическая чистота целевого соединения: ,0°. Синтез осуществлен по схеме2. Схема 2 (описываемый способ) 5 6 7 в Thr Pro Ьуз . Thr

Вое Bu

t :-oH

72,7%

OMe

У

Bu

OH H

У1а

триэтиламина в 80 мл этилацетата. Далее реакционную смесь охлаждают до 20 С, полимер отфильтровывают, последовательно промывают этнпацетатом, этанолом, водой, этанолом, диоксаном, обрабатывают 4н. раствором хлористого водорода в хлористом метилене, промывают, диоксаном и эфиром и сушат в вакууме. Для определения количества аминокислоты на полимере-носителе 20 мг полуz -f- 27,J- OBu Boc Bu H / py

5

ченного гидрохлорида фенилаланилполимера подвергают гидролизу при . в течение 5 ч в смеси 12 н. соляной и пропионЬвой кислот (по 2. мл) и фильтруют . По данным аминокислотного анализа остатка после упаривания фильтрата количество фенйлаланина на полимере составляет 0,90 ммоль/г.

Дпя построения пептидной цепи на полимере фенилаланил-полимер (8,8 г содержание аминокислоты 7 ,9 ммоль) дважды подвергают следующему циклу обработок соответствующими растворителями и реагентами (объем растворителей при каждой обработке 70 мл):

1)Промывка диоксаном, 2x3 мин.

2)Обработка 4,5 н. НС1 в диоксане, 1.хЗО мин.

3)Промьшка диоксаном, 3x3 мин.

4)Промьшка хлористым метиленом, 2x3 мин.

5)Обработка 10 %-ным раствором триэтиламина в хлористом метилене, 1x10 мин.

6)Про№ 1вка хлористым метиленом, 4x3 мин.

7)Добавление 24 шоль N-третбутилоксикарбрнилфенилаланина в хлористом метилене.

8)Внесение в реакционную смесь 12 ммоль дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК)(начало конденсации).

9)Через 1 ч добавление еще

12 ммоль ДЦГК в хлористом метилене.

10)Через последующие 2 ч промывка хлористым метиленом, 3x3 мин (окончание конденсации).

1I)Обработка смесью 4 мл уксусного ангидрида и 2 мл триэтиламина в хлористом метилене для блокирования возможных свободных аминогрупп, не вступиввшх в реакцию конденсации, 1x30 мин.

При повторении цикла (введение пептидную цепь Ы-бензилоксикарбонилглицина) на стадиях 6-10 в качестве растворителя используют диметилформамид (даФА), поскольку N-бензилоксикарбошшглицин в хлористом метилене не растворяется.

По окончании наращивания пептидной цепи N-бензилоксикарбонилглицилфеннлаланил-фенилаланин-полимерпромьшают этанолом, уксусной кислотой и эфиром и сушат в вакууме.

1Q6

Полученный N-бензилоксикарбонилглицил-фенилаланил-фенилаланин-полимер обрабатьшают смесью 10 мл 2 н. NaOH и 90 мл метанола (2 раза по 15 мин), промывают метанолом и объединенные .фильтраты подкисляют

лимонной кислотой. Образовавшийся . осадок.отфильтровывают, промывают метанолом и объединенные фильтраты упаривают. Остаток переосаждают из метанола водой, промывают водой,

сущат в вакууме над Р.,.05 и перекристалллзовывают из этилацетата.

Выход 3,7 г (92 %) (в расчете на С - концевой фенилаланин, присоединенный к полимеру), белое кристаллическое соединение, т.пл. 178-179 С. /Х / + 17,0° (с 1, ). Rf 0,80 (I-бутанол.-пиридин-уксусная кислота-вода 15:10:3:12), Rf 0,94 (l-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:1 )

(тех на пластинках Силуфол, ЧССР).

Найдено,% : С 66,63; Н 5,97: N 8,45.

.

Вычислено,%: С 66,79; Н 5,81; N 8,34.

Аминокислотный анализ: Gly 1,00; Phe 2,04. ...

П. Получение трет-бутилового эфира 0-трет-бутилтирозил-треонил-пролил-N -трет-бутилоксикарбониллизил0-трет-бутилтреонина (ш).

П.1. Метиловьй эфир N-бензилоксикарбонил-0-трет-бутилтирозил-треонина (1У).

К раствору 1,8 г (10,5 ммоль) гидрохлорида метилового эфира треонина в 15 мл ДМФА при прибавляют 1,5 мл .(10,5 ммоль) триэтиламина, через 10 мин при -10°С вносят раствор 3,34 г (9,0 ммоль) N-бензилоксикарбонил-0-трет-бутилтирозинав 10 мл тетрагидрофурана (ТГФ) и 1,21 г (9,0 толь) 1-оксибензотриазола, после чего при добавляют

раствор 1,85 г (9,0 ммоль) ДЦГК в 5 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивают 1,ч при ОС н 24 ч при 20 С и осадок отфильтровывают. Фильтрат упаривают, остаток pacтвopяюf в

этилацетате, последовательно промывают 5 %-ным.раствором лимонной кислоты, водой, 5 %-ным раствором бикарбоната натрия, водой и сушат над NajSO/, . Этиацетатный раствор упаривают, маслообразный остаток хроматографируют на колонке с сили кагелем .Вельм (ФРГ), используя дляэлюирования бензол и затем смесь бензола с этилацетатом 1:2. Фракции, содержащие основное вещество (контроль с помощью тех), упа ривают, остаток сушат в вакууме. .Выход 3,20 г (72,7%), белое кри сталлическое соединение, т. пл. 9495С, 8,5 (с 1, МеОН). Rf . 0, (2-бутанол 3 %-ный аммиак 3:1), Rf 0,32 (этилацетат-петро лейный эфир 3:1) (ТСХ), Найдено,%: С 64,05; Н 7,19; N 5,69.. СгбНз NjO;: . Вычислено,%: С 64,17; Н 7,04; N 5,75. П.2. N-Бензилоксикарбонил-О-тре бутилтирозил-треонин (1Уа). К 0,56 г (1,15 ммоль) метиловог эфира N-бензилоксикарбонил-О-третбутилтирозил-треонина (см. п. П.) в 5 мл метанола добавляют 1,18 мл (1,18 ммоль) 1 Н. NaOH и перемешив ют 3 ч при 20 С. Реакционную смесь охлаждают до , подкисляют 1 н. ляной кислотой до рН 6-7 и упаривают.. Остаток растворяют в 50 мл 0,05 н, NaOH, экстрагируют зтилацетатом, водную фазу отделяют, охлажд ют до и подкисляют 1 н. соляной кислотой до рН 3, Маслянистый осадо экстрагируют этилацетататом, промыв ют водой, сушат над NajSO и упарив ют . Образовавшийся твердый остаток сушат в вакууме. Выход 0,51 г (94%), белое аморф ное вещество. -2,7 (с1, МеОН). Rf 0,25 (2-бутанол-3%-ный а 3:1). Rf 0,32 (ацетон-хлороформ 1:1), Rf 0,40 (хлороформ-мета нол 18:2,5) (тех). Найдено,%: С 63,31; Н 6,76; N 5,99. CisHj N Or. Вычислено,%: С 63,32; Н 6,83; N 5,92. П.З. трет-Бутиловый эфир N -бен зилоксикарбонил-N -трет-бутилоксикарбониллизил-0-трет-бутилтреонинаК раствору 0,94 г (4,0 ммоль) трет-бутилового эфира 0-трет-бутил треонина в 5 мл ТГФ добавляют 1,54 (4,0 ммоль) Н -бензилоксикарбонилтрет-бутилоксикарбониллизина в 108 5 мл ТГФ и 0.,54 г (4,0 ммоль) 1-оксибензотриазола, охлаждают до Ос и вносят 0,84 г (4,0 ммоль) ДЦГК в 2 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивают 1 ч при при 20С,осадок удаляют фильтрованием, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промьшают водой, 2 %-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным раствором бикарбоната натрия и водой и сушат над NajSO . Этилацетат упаривают, остаток (масло) хроматографируют на силикагеле Бельм, используя в качестве элюента смесь этилацетата и петролейного эфира 3:1. Фракции, содержащие основное .вещество (ТСХ), упаривают, остаток сушат в вакууме. Выход 1,97 г (82 %), бесцветное масло. /сС/р +6,6° (с 1, CHClj). Rf О,-65 (ацетон - хлороформ 1:2), Rf 0,45 (этилацетат-петролейный эфир 3:1)(ТСХ). Найдено,%: С 62,39; Н 8,59; N 7,31.CjiHsfN O. Вычислено,%: С 62,70; Н 8,66; N 7,08. П.4. трет-Бутштовый эфир N -третбутилоксикарбониллизнл-0-трет-бутилтреонина (Уа). В раствор 1,42 г (2,40 ммоль) трет-бутш1ового эфира Н -бензилоксикарбонил-N -трет-бутилоксикарбониллйзил-О-третбутилтреонина (см. п. П.З) в 25 мл метанола вносят 50 мг палладиевой черни и смесь перемешивают в атмосфере водорода .в течение 5 ч. Затем катализатор отфильтровывают, фх пьтрат упаривают в вакууме, остаток сушат в вакууме. Выход 1,1 г (100 %), масло. Rf 0,35 (хлороформ-метанол 9:1), Rf 0,80 (2-бутанол-З %-ный аммиак 3: 1) (тех). П.5. трет-Бутиловый эфир N-бензилоксикарбонилпролилЧМ -трет-бутилоксик арб онилли зил-О-тр ет-бутилтреонина (У1). К 1,1 г (2,4 ммоль) трет-бутилового эфира К -трет-бутилоксикарбониллизил-О-трет-бутилтреонина(см. п. П.4) в 5 МП ТГФ добавл ют раствор 0,56 г (2,4 моль) N-бензилоксикарбоннппролина в 5 мл ТГФ и 0,34 г (2,4 ммоль) 1-оксибензотриазола и охлаждают до ОС. Далее прибавляют 0,52 г (2,4 ммоль) ДЦГК в 2 мл ТГФ и реакционную смесь перемешивают 1 ч при и 5 ч при . Осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток растворяют в этилацетате и промывают водой, 2 %-ной лимонной кислотой, 5 %-ным бикарбонатом натрия и водой. Этилацетатный раствор сушат над NajSO, упаривают, остаток кристаллизуют из смеси этилацетата и петролейного эфира и сушат.

Выход 1,42 г (85 %), белое кристаллическое соединение, т.пл. Ш9ПО°С. /сС/р - 46, (с }, МеОН). Rf 0,80 (2-бутайол-З %-ный аммиак 3:1), Rf 0,63 (ацетон-хлороформ 1:1) Rf 0,36 (ацетон-хлороформ 1:3) (ТСХ)

. Найдено,%: С 62,69; Н 8,46; N 8,09.

C - eHr8N(,Oj .

& 1числено i С 62,58; Н 8,46; N 8,11.

Аминокислотный анализ: Pro 1,00; Lys 1,04; Thr 0,95.

П.6. трет-Бутиловый эфир пролилN -трет-бутилоксикарбониллизил-Отрет-бутилтреонина ().

В раствор 0,621 г (0,90 ммоль) трет-бутилового эфира N-бензилоксикарббнилпролил-N -трет-бутилоксикарбониллизил-0-трет-бутилтреонина(см. п. П.5) в 10 мл метанола вносят 100 мг палладиевой черни и смесь перемешивают в атмосфере водорода в течение 6 ч. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме,остаток также сушат в вакууме .

Выход 0,53 г (100 %), масло. Rf 0,51 (I-бутанол-уксусная кислотавода 4:1:1), Rf 0,40 .(2-бутанол3 %-ный аммиак 3:1) (ТСХ).

П.7. трет-Бутиловьй эфир N-бензш1оксикарбонил-0-трет-бутш1тирозш1треонил-пролия-N -трет-бутнлоксикарбониллизил-О-трет-бутилтреонина (УП)

К раствору 0,53 г (0,90 ммрль) трет-бутилового эфира пролил-И -третбутилоксикарбоншшизил-0-трет-бутилтреонина (см. п. П.6) в 2 мл ДМФА прибавляют 0,42 г (0,90 ммоль) N-бензилоксикарбонил-0-трет-бутилтирозилтреонина (см. п. П.2) в 2 мл даФА и 0,122 г (0,90 ммоль) 1-оксибензотриазола, после чего при ОС вносят 0,196 г (0,90 ммоль) ДЦГК в 1 мл . Реакционную смесь перемешивают 1 ч при при 20°С, осадок отфипьтровьшают, к фильтрату добавляют 40 мл охлажденной воды (5 С) и

образовавшееся масло экстрагируют этилацетатом (3 раза по 30 мл).Экстракт промьшают насьш(енным раствором хлорида натрия, 5 %-ным раствором лимонной кислоты (3 раза по

30 мл), 5 %-ным раствором бикарбоната натрия (З раза по 30 мл) и водой, .сушат над , и упаривают.. Остаток хроматографируют на силикагеле Вельм, последовательно используя для элюирования бензол и смеси бензола с этилацетатом 1:1 и 1:2. Фракции, содержащие по данным ХСХ основное вещество, упаривают в вакууме, твердый остаток сушат в вакууме.

Выход 0,65 г (60 %), белое кристаллическое соединение, т.пл. 8790°С ) - 48,1° (с 1; МеОН). Rf 0,53 (ацетон-хлороформ 1:1),

Rf 0,62 (хлороформ-метанол 18:2,5), Rf 0,86 (н-бутанол-уксусная кисло- . та-вода 4:1:1 ) (ТСХ).

Найдено,%: С 62,97; Н 8,23; N 8,28.

C jHg NeOij.

Вычислено,%: С 62,94; Н 8,19; N 8,30.

Аминокислотный анализ: tyr 0,91; Thr 2,01; Pro 1,00; Lys 1,10.

П.8. трет-Бутиловый эфир 0-третбутилтирозил-треонилпролил-Н -третбутилоксикарбониллизил-0-третбутил-треонина (Ш).

0,65 г (о,64 ммоль) трет-бутилового эфира N-бензилоксикарбонил-Отрет-бутилтирозил-треонил-прслилN -трет-бутилоксикарбониллизил-0трет-бутилтреонина (см. п. П.7) растворяют в 10 мл метанола, добавляют 100 мг палладиевой черни и перемешивают в атмосфере водорода в течение 6 ч. Катализатор отфильтровывают, 4 1льтрат упаривают, остаток сушат в вакууме. Выход 0,53 г (97 %), белое

аморфное соединение, Rf 0,40 (2-бутанол-3 %-ный аммиак.3:1), Rf 0,24 (хлороформ-метанол 18:2,5) (ТСХ),

Найдено,%: С 61,81; Н 8,79; N 9,43.

,.

Вычислено, % С 61,62; Н 8,73; N 9,58.

Аминокислотный анализ: Туг 0,96; Thr 1,92; Pro 1,00; Lys 1,05.

Ш.Получение трет-бутилового эфира N-бензилоксикарбонилглицилфенилаланил-фенилаланил-0-трет-бутилnтирозилтреонил-пррлил-К -трет бутил оксикарбониллизил-0-трет-бутилтреонина (1). 0,53 г (0,60 ммоль) трет-бутилового эфира 0-трет-бутилтирозил-трео нил-прсшил-N -трет-бутилоксикарбониллиэил-0-трет-бутилтреонина(см. п. П.8) растворяют в 3 мл ДМФ добавляют раствор 0,31 г (0,60 ммол К-бензштоксикарбонилглицил-фенилала нил-фенилаланина (см. п. 1.3) в 2 м ДМФА, 0,081 г (0,60 ммоль) 1-оксибензотриазола, после чего охлаждают до О С и прибавляют 0,125 г (0,60 ммоль) ДЦГК. Реакционную смес перемешивают 2 ч при 0С и 6 ч при , осадок отфильтровывают, фильт рат смешивают с 30 мл охлажденной воды (5°с) и образовавшееся масло экстрагируют этилацетатом (3 раза по 25 мл). Экстракт промывают насыщенным раствором хлорида натрия, 5 %-ным раствором лимонной кислоты (З раза по .20 мл), 5 %-ным раствором бикарбоната натрия (3 раза по 20 мл) и водой, сушат над NazSO/, и упаривают. Остаток хроматографируют на колонке с окисью алюминия ( Tl степень активности по Брокману испЬльзуя для элюирования этилацетат и затем смес.ь хлороформа и метанола 18:2. Фракции с основным веществом (тех) упаривают в вакууме, pc-faTOK кристаллизуют из этилацетата и петролейного зфира, осадок отфильтровывают и сушат, в вакууме. 0 Выход О,/О г (84 %), белое кристаллическое соединение, т.пл. 118120С /«:/( - 52,0 (с 1, МеОН). Rf 0,26 (ацетон-хлороформ 1:1), Rf 0,80 (2-бутанол-З %-ный аммиак 3:1), Rf 0,86 (1-бутанол-уксусная кислота-вода .4:1:1) (ТСХ). Найдено,%: С 64,25; Н 7,88; N 9,38. С73 HwjNg Qf«. Вычислено,%: С 64,34; Н 7,62; N 9,25. Аминокислотный анализ: Gly 1,00; Phe 2,00; Туг 0,95; Thr 1,93;. Pro 0,90; Lys 1,04. Описываемый способ позволяет получать промежуточные и конечное соединение - октапептид 1 с достаточно высоким выходом (выход на заключительной стадии 84 %; суммарный выход 46 %) без применения какихлибо специальных методов выделения и очистки. В известном способе суммарный выход октапептида-1 составил 24 %. Одновременно октапептид-1, полученный описываемым способом, обладает значительно большей стереохимической чистотой (удельное вращение - 52 ), чем тот же октапептвд, синтезированный известным способом (удельное вращение - 37,7°). Использование описываемой схемы синтеза позволит существенно снизить себестоимость конечного продукта за счет снижения расхода промежуточньЕХ соединений на конечной стадии.