Способ определения транспорта ионов калия грамотрицательными бактериями Советский патент 1982 года по МПК C12K1/00 

(St) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРАНСПОРТА ИОНОВ КАЛИЯ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

I

Изобретение относится к медицине, и. частности к микробиологии, и может быть использовано для оценки физиологического состояния грамотрицательных бактерий в микробиологической промышленности, а также в биохимических, микробиологических и биофизических исследованиях.

Известен способ, определения транспорта ионов калия грамотрицательны ми бактериями с использованием ионоселективных электродов tl. , Однако известный способ не позволяет точно определить транспорт ионов калия.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что суспензию бактерий вносят в раствор сахарозы или маннита в концентрации 250-500 мМ, затем вводят раствор хлорида калия в концентрации . 1,0-10,0 мМ, и определяют транспорт

ионов калия регистрацией изменения светорассеяния суспензии во времени. Способ осуществляют следующим образом;

Гомогенную суспензию отмытых в дистиллированной воде бактерий в концентрации кл/мл помещают в , оптическую кювету, содержащую раствор сахарозы или маннита (250-500 мМ). Через 1-2 мин регистрируют изменения

10

светорассеяния суспензиибактерий при

.свете с длиной волны 500-600 нм. Затем в кювету вносят хлористый калий до конечной концентрации 0,1-VO мМ и регистрируют уменьшение светорас15сеяния во времени. Динамика изменений светорассеяния при этом однозначно отражает накопление бактериями

ионов калия . Измерения изменений све- торассеяния бактериальной суспензии

20 проводят на флуориметре, спектрофотометре или фотоэлектрокалориметре

по точкам-или с использованием реги стрирующего -самописца. . 391 На чертеже показана зависимость интенсивности светорассеяния суспензии бактерий от времени. Пример 1. Эксперимент проводится на Esherichia CoBi и Pseudomonas aeruginosa. Результаты, полученные на обоих представителях грамотрицатеяьных бактерий, одинаковы. В оптическую кювету помещают раствор 250 мМ сахарозы, к которому добавляют дважды отмытые в дистиллированной воде и ресуспендированные в воде до гомогенности клетки бактерий до конечной концентрации 5 10кл/мл лКювету помещают в флуориметр и региртрируют светорассеяние при 600 нм под углом . К суспензии добавляюt хлористый калий до конечной концентрации 10 мМ, перемешивают в течение 3-5 с и регистрируют уменьшение светорассеяния клеточной суспензии во времени. На чертеже показан харак тер получаемой зависимости светорассеяния от времени (стрелкой показан момент добавки КС В). Зарегистрированное уменьшение светорассеяния сус пензии бактерий в указанных условиях однозначно отражает энергозависимое накопление ионов калия клетками.Ионы натрия до концентрации 50 мМ не сказываются на регистрируемой реакци и. Тождественные результаты получают ся при регистрации изменений оптичес кой плотности суспензии бактерий. П р и м ер 2. Берут бактерии Е.CoBi, дважды отмытые в дистиллированной воде, и готЬвят из них гсжогенную водную суспензию с концентрацией клеток 10 кл/мл. Суспензию делят на три порции.: две опытных и од.ну контрольную. Первую опытную пробу объемом 0,5 мл замораживают в стеклянной пробирке до - путем быстрого погружения пробирки в жидкий азот, где ее выдерживают мин. После этого пробирку вынимают из жид кого азота и размораживают при комнатной температуре. Вторую опытную пробу объемом О 5 мл замораживают до - на сухом льду и лиофилизируют nocjie лиофилизации регидратируют добавкой 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольный образец хранится все время при кЬмнатной температуре, без каких-либо обработок,Во всех Tfiex образцах регистрируют калий-транспортирующую активность предлагаемым способом. В табл. 1 представлено изменение параметров калий - транспортирующей активности бактерий Е, CoBi после низкотемпературного замораживания и лиофилизации. Из данных табл. 1 следует, чТо как замооажийание так и лиофилизация отрицательно сказываются на калийтранспортирующей активности бактерий. Причем после замораживания практичес ки все клетки в популяции сохраняют Ьпособность накапливать ионы калия (параметр Н не изменяется), хотя и с меньшей скоростью, по сравнению с контролем (параметр 1/2 увеличивается) . Прсле лиофилизации клеток способных накапливать ионы калия, в по-пуляции уменьшается (параметр Н уменьшился), но у остальных клеток калий-транспортирующая активность изменяется меньше, чем после замораживания. Пример 3. Берут бактерииE.CoPi, дважды отмытые в дистиллированной воде, и готовят из них гомо,генную водную суспензию с концентраДией клеток 10 кл/мл. Суспензию делят на четыре порции: три опытных и одну контрольную. В первую опытную пробу вносят грамицидины Д до концентрации 20 мкг/мл. Во вторую опытную пробу вносят этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) до концентрации 0,1 мН. В третью опытную пробу вносят ЭДТА до концентрации 0,1 j«iM и грамицидин Д до концентрации 20 мкг/мл. В контрольный образец добавок не делают,. Во всех образцах измеряют калий-транспортирующую, активность предлагаемым способом. В табл. 2 представлено изменение параметров калий-транспортирующей активности Е.СоВ после обработки грамицидином Д. Из данных табл. 2 следует, что после обработки бактерий E.CoBi грамицидином Д в присутствии ЭДТА практически все клетки утрачивают способt-jpcTb накапливать ионЫ калия из-за повышенной пр01чицаемости для одновалентных ионов у цитоплазматических мембран, которую индуцируют .антибиот тик. Без ЭДТА мембраны E.CoBi не чувствительны к данной концентрации антибиотика. . Предлагаемый способ позволяет повысить точность определения транспор та ионов калия и может быть использован для характеристики физиологическогоа также пример,

Формула изобретения.

Способ определения транспорта ионов калия грамотрицательными бактериями, отличающийся тем, что, целью повышения точности способа, суспензию бактерий вносят в раствор сахарозы или маннита в концентрации 250-500 мМ, затем вводят

раствор хлорида калия в концентрации 1,0-10,0 мМ и определяют транспорт ионов калия регистрацией изменения светорассеяния суспензии во времени.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

I.Durgarian S.S ., Marti rosov S.M, Bioelectrochem. Bioenergetics. t978, 5, 3. 55. 59127526 статуса популяции бактерий, щих приемов (замораживания, лиофилицелостности их мембран, на- зации) антибиотиков мембранного дейпосле действия консервирую- ствия. - Таблица jpete с 10ше&.)

U0

if/

r tf/irmj

15 ffp Mf/ ift/ffffl// m--)(flopcpeki /r H S f p03fff . Off t O/ f/f/i/ff