Способ оценки жизнеспособности грамотрицательных бактерий Советский патент 1982 года по МПК C12Q1/04 

.(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ }ШЗНЕСПОСОБНОСТИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

I

Изобретение относится к микробио логин, а именно к исследованиям микробиологических объектов.

Известны способы быстрой (экспресс-) оценки жизнеспособности культуры г.рамотрицательных бактерий, ос-, нованные на исследовании тех или иных повреждений клеток П.

Однако указанные способы не могут быть, использованы, для оценки процентной доли жизнеспособности бактерий после замораживания.

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ оценки жизнеспособности грамотрицательных бактерий, предусматривающий приготовление бактериальной суспензии и ее замораживание 2 .

Способ заключается в высеве бактериальной суспензии после замораживания на питательную среду с последующим подсчетом колоний.

Недостатками известного способа являются длительность анализа (не менее 8ч), большая трудоемкость и большой расход реактивов.

Цель изобретения - сокращение времени анализа, а также упрощение и удешевление способа.

Поставленная цель достигается тем, что по способу оценки жизнеспособности грамотрицательных бактерий,

10 предусматривающему приготовление бактериальной суспензии и ее замораживание, перед замораживанием и после него измеряют светорассеяние бактериальной суспензии сначала в 300 мМ

15 растворе КСЕ. , а затем в дистиллированной воде, после чего определяют разность светорассеяния, а по соотношению разностей светорассеяние после и до замораживания судят о жиз-

20 неспособности бактерий.

Способ основан на том, что в ходе замораживания и последующего оттаивания происходит нарушение барьерных СВОЙСТВ цитоплазматической мембраны бактерий. Это приводит к двум после .ствиям: изменяется коэффициент преломления внутриклеточного содержимого и возрастает проницаемость мембран для неорганических ионов в том числе ионов К . Все это пр1гводи к уменьшению плазмолитической реакции клеток при помещении их в гипер тонический раствор КС (ЗОО мМ). Именно это уменьшение и регистрируется по ослаблению светорассеяния замороженных клеток в растворе KCt по сравнению с интактными клетками. Способ осуществляют следующим об разом. Часть водной сусп.ензии бактериал ных клеток в концентрации 10 подвергают замораживанию и оттаиванию. Измеряют интенсивность светора сеяния немороженых и мороженых клеток в строго одинаковой концентрации в 300 мМ растворе хлористого калия и в воде. Светорассеяние,изме ряют под углом 90. Длииа волнь падающего света 500-600 ю. Разност между интенсивностью светорассеяния немороженых клеток в растворе КС1 и в воде принимают за 100%. Эту же величину измеряют у клеток, подвер нутьгх замораживаншо и оттаивйнию, и выражают, ее в процентах по отношению к интактным клеткам. Полученная величина характеризует долю жиз неспособности клеток в суспензии после замораживания. Пример. Клетки Escherichia col I u Pseudomonas acrugfnosa вырашивают до стационарной фазы роста, отмьюают от культуральнбй жидкости и рассуспензируют в дистиллированной воде до гомогенности. Суспен зию каждого вида микроорганизмов в концентрации кл/мл делят на две части - . контрольную и опыт

Escherichia соП ЮОМ 59М

Pseudonranas acruginosa100 5 82±6 ную. Контрольная суспензия не подвергается каким-либо воздействиям. В таблице показана жизнеспособность бактерий Escherichia coli и Pseudonxanas acruginosa, %, после замораживания и оттаивания, измерен нал с помощью метода десятикратных разведений и предлагаемого метода. Опытную пробу объемом 0,5 мл в стеклянной пробирке погружают в жидкий азот, где выдерживают 1520 мин и размораживают при комнатной температуре. В оптическую кювету, содержащую раствор 300 кое , помещают суспензию бактерий, служащую контролем, 10 кл/мл до конечной концентрации и перемешивают в течение не более с. На флуориметре измеряют интенсивность светорассеяния суспензии под углом 90 при 500-600 нм. Светорассеяние суспензии бактерий в растворе 300 мМ КСЕ изменяется во времени. Б течение первых 1020 с, оно возрастает, а затем начинает уменьшаться. Измерение светорассеяния проводят в максимуме. Это измерение удобно проводить с использованием самописца. После измерения светорассеяния в растворе KCt проводят измерение светорассеяния в дистиллированной воде находят разность между первой и второй измеренными величинами. Описанньм способом регистрируют разность светорассеяния суспензии опытных бактерий в растворе 300 М-М КСЕ и дистиллированной воде, для опытных бактерий по отношению к контрольным. Эта величина характеризует число жизнеспособных клеток в популяции бактерий после замораживания - оттаивания. Вычисляют процентную долю разности светорассеяния в КСВ и воде. Предлагаемый способ измерения числа жизнеспособных грамотрицатель ных бактерий после замораживания и оттаивания имеет следующие преимущества: время анализа уменьшается с 8 ч до 10 мин; для осуществления предлагаемого метода необходим лишь один реактив - КС(, а не сложная дорогостоящая питательная среда; предлагаемый метод включает две простых операции - суспедирование образца в оптичеркой кювете и регис рацию светорассеяния на флуориметре Формула изобретения Способ оценки жизнеспособности . грамотрицательных бактерий, предусматривающий приготовление бактериальной суспензии и ее замораживание отличающийся тем, что, с целью сокращения времени анализа, а также упрощения и удешевления способа, перед замораживанием и после него измеряют светорассеяние; бактериальной суспензии сначала в 300 мМ растворе КС, а затем в дистиллированной воде, после чего определяют разность светорассеяния, а по соотношению разностей светорассеяния после и до замораживания судят о жизнеспособности бактерий. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Фихман Микробиологическая рефрактометрия. М., Медицина ., 1967 с. 191-240, 2.Postgate I.R., Huuter I.R. On the survival of ffogen bacteria. J. Geu. MJcrobiol, v. 26. 1961, p, 367-378.