Штамм SтRертомYсеS FRaDIae - продуцент рестриктазы SFR I Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к выявлению микроорганизма, способного синтезировать эндонуклеазу рестрикции, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов CCGCGG и названную согласно общепринятой номенклатуре Sfr 1„

Цель изобретения - выявление штамма - продуцента Stireptomyces fradiae ВКПМ S-866 (303), нетребовательного к питательным средам и синтезирующего одну рестриктазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG с высоким выходом„

Ытамм So fradiae 303 получен в результате поиска продуцентов рестрнк- таз среди микроорганизмов группы стрептомицетов о

Предлагаемый штамм обладает следующими свойствамио

Морфологические: клетки нитевидные, неподвижные, грамположительные, на крахмало-аммиачной среде образуют вросиие колонки; воздушный мицелий белый или серо-розовый, субстратный- грязно-желтоватый., Споры овальные

О

сд

со

спороносцы спиральные о На глицерин- нитратном агаре: воздушный мицелий (ВМ) - желтовато-белый, субстратный мицелий (СМ) - желтовато-рыжеватый, растворимый пигмент (РП) - отсутствует

На рыбно-питательном агаре: ВМ - отсутствует, колонии кожистого типа; СМ - рыжеватый; РП - нето

На овсяном агаре: ВМ - серо-розовый, СМ - лелтовато-бурый, РП - нет,,

На минеральном агаре: ВМ - бело- розовый, СМ - желто-розовый; РП-нет

Физиологические и биохимические свойства: факультативный аэроб, темг пературный оптимум 30°С, рН среды 7,0-7,5с Культура ферментирует глюкозу, галактозу, арабинозу, салицин; восстанавливает нитраты, разжижает желатин, не выделяет индол, сероводород, амилазоположителен, тирозин не ферментируете Обладает антагонизмом по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям, но не к дрожжамо Меланоидные пигменты не образует„

11тамм не усваивает маннит, инозит сахарозу: слабо усваивает рафинозу, обладает амилазной и желатиназной ак тивностью, растет на клетчатке; не содержит тирозиназуо

Устойчивость к антибиотикам: штам устойчив к пенициллину, мономицину, неомицину, карбенициллину, оксацилли ну, ампициллину, сульфатназолуо

Цтамм хранится в лиофильно-высу- ыенном состоянии и в растворе 30%-го глицерина при -609С„

Для культивирования S fradiae 303 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды: БВК 20, NaCl 5,0; глюкоза 3,0; рН 7,2с Культивирование проводят при 30°С с хорошей аэрацией в течение 48 ч. Выход сырой биомассы составляет в среднем 40 г/л культуральной

ЖИДКОСТИо

Выход фермента составляет 30000- 35000 ед0акт,,/г влажной биомассы, что в 15-17 раз больше, чем известного.

Полученная рестриктаза Sfr I характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расцепляют последовательность нуклеотидов CCGCG оптимальное значение рН для действия рестриктазы 7,5-8,0; оптимальная температура действия 37 С, активность

сохраняется также при 50°С; оптимальная концентрация ионов Mg4 5-15 мМ„ NaCl 50 мМ.

Электрофореграмма продуктов гидролиза ДНК фага С1 857 рестриктазами Sfr I и Sac II и Sac II показывает, что картина гидролиза полностью совпадает как при параллельном, так и совместном гидролизе„ Следовательно, рестриктаза Sfr I является изошизоме- ,ром рестриктазы Sac II, узнает и расцепляет последовательность нуклеотидов CCGCGG„

Пример 10 Получение биомассы S. fradiae 303„ Клетки S. fradiae 303 храняциеся в 30%-ном растворе глицерина в питательной среде при -20°С, высевают на чашку с плотной питательной средой и инкубируют при 30°С в течение 44-48 ч0 Затем клетки вносят бактериологической петлей в колбу с 50 мл жидкой питательной среды, г/л дистиллированной воды: БВК 20 г/л; NaCl 5,0 г/л, глюкоза 3,3 г/л; рН 7,2 и выращивают на качалке при 30°С в течение 30 чо Полученную культуру используют для засева 200 мл среды Выращивание проводят также на качалке со скоростью 150-200 об/мин в течение 48 ч„ Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин на центрифуге Mistral „ Выход сырой биомассы составляет 38 г/л культуральной жидкости

Пример 2„ Выделение сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции Sfr I.

10 г влажной биомассы суспендируют в 30 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера рН 7,5, содержацего 0,01 М 2-мер- каптоэтанол и 1 мМ ЭДТА, озвучивают на дезинтеграторе УЗНД-2Т ч диапазоне 22 кГц 4-8 раз по 30 с, с таким же интервалом центрифугируют (18000 об/ми 60 мин., 4°С) и к полученному супер- натанту добавляют сульфат аммония до 75%-го насыщения о Суспензию выдерживают 18 ч при 4°С и центрифугируюто Полученный осадок растворяют в 20 мл 0,02 М калий-фосфатного буфера, содержацего 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,5 мМ ЭДТА, 0,1% тритон Х-100 и 0,8 М NaCl (буфер А)„ Раствор наносят на колонку с Ьиогелем А 0,5 М (Bio Had), объемом 500 мл, уравновешенную буфером А, и ведут элюцию тем же буфером со скоростью 20 мл/ч. Фракции объемом 10 мл собирают и анализируют на наличие

фермента„ Фракции, содержацие максимальную рестриктазную активность, объединяют и диализуют против 2 л 0,02 М калий-фосфатного буфера рН 7,5, содержащего 1 мМ 2-меркаптоэта- нол и 0,5 мМ ЭДТА (буфер В), меняя буфер дваждыJ Диализуют, наносят на колонку объемом 30 мл с ДЕАЕ-целлкшо- зой (ДЕ-52, Whatman), уравновешенную буфером В„ Колонку промывают буфером В и адсорбированный фермент элюиру- ют 300 мл градиента NaCl (0,01-1,0 М в буфере В„ Фермент после диализа наносят на колонку с фосфоцеллюло- зой (Р-II, Whatman) объемом 10 мл, уравновешенную буфером В, и промывают колонку тем же буфером Элюцию фермента проводят 200 мл градиента NaCl (0,0-1,0 М) в буфере В„ Фракции содержащие рестриктазу, элюируют при( 0,60-0,07 М NaCl, объединяют и диализуют против буфера В, содержащего 0,1 М NaCl и 50%-ный глицерин

Ферментный препарат хранится при

не менее 6 мес„, хорошо транспортируется в термосе с сухим льдом„ Выход фермента ЗОООЭ ед.акт/г биомассы активность ЗОЭЭО ед/мл.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента,

-20°С

.

0

5

0

5

необходимое для полного расцепления 1 мкг ДНК фага CI 857 в течение 1 ч при 37 аС„

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Sfr 1„

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Sfr I, проводят гидролиз ДНК фага ft CI 857 рестриктазами Sfr I и Sac II по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазамИо Наблюдаемая картина полного совпадения фрагментов, полученных при параллельном и совместном гидролизе, указывает на то, что рестриктаза Sfr I является нзопизомером рестриктазы Sac II, узнает и расщепляет последовательность CCGCGC.

Поскольку рестриктаза Sfr I, имеет сайт узнавания CCGCGG, идентичный сайту узнаваннч Sac II, она может заменить Sac II в экспериментах по фрагментации ДНК п8 этим сайтам

Формула изобретения

Цтамм Streptonycee fradiae ВКПМ S-066 - продуцент рестриктазы Sfr 1„

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретения является выявление ново го штамма - продуцента Streptomvces fradiae В1СПМ S-866, нетребовательно2X/ го к питательным средам и синтезирующего одну рестриктазу, способную узнавать и расцеплять последовательность нуклеотидов CCGCGG с высоким выходом0 Штамм получен в результате поиска продуцентов рестрпктаз среди микроорганизмов группы стрептомицетов, растет на простой дешевой питательной среде отечественного производства, обеспечивает повышенный выход рестриктазы при более простом экономическом способе выделения фермента по сравнению с известной Из 1 г влажной биомассы выделяют 30000-35000 уд, фермента с удельной активностью 30000 ед/мл,- Ытамм Streptomyres fradiae (303) S-866 продуцирует рестриктазу Sfr I, имеет сайт узнавания CCGCGG, идентич- HLDI сайту узнавания Sac .II, и может заменить Sac II во всех генно-инженерных работах„ % Л