Способ количественного определения адренорецепторов в клеточных мембранах Советский патент 1982 года по МПК G01N24/10 G01N33/50 

Изобретение относится ft исследованию биологических веществ, в частности к способам количественного определения адренорецепторов в биологических объектах, и может быть использовано в иммунохимии для анализа например, клеточных мембран. Известен способ количественного определения ад -1енорецёпторов в клеточных мембранах, включающий взаимодействие исследуемого объекта с меченым биогенным амином; а затем с, немеченым соединением иной химической структуры и сравнение результатов специфического и неспецифического связывания меченого биогенного амина с исслед емым объектом. В качестве меченого биогенного акшна используют радиоактивномеченый биоген ный амин. Причем сначала один образец биологического объекта в виде гомогенизата подвергают взаимодейст вию с радиоактивномеченным биогенным амином, затем отмывают избыток непрореагироваБше1о соединения и измеряют радиоактивность образца. Пос ле этого второй образец биологическ го объекта подвергают йзаимодействи садреноблокатором, а затем с радио активным меченым биологическим амином, отмывают избыток непрореагировавшего соединения и измеряют радиоактивность второго образца. Сравнивая радиоактивность первого и второго образцов судят о количестве адренорецепторов в клеточных мембранах tl . к недостаткам известного способа относятся невысокая .точность количественного определения, длительность анализа, использование двух различных образцов биологического объекта и нестабильность радиоактивномеченого биогенного амина. Целью изобретения является повышение точности, информативности и интенсификации способа. Поставленная цель достигается тем, что в качестве меченого биогенного амина используют спин-меченый биогенный амин общей формулы К-Б -(У г где К - биогенный с1Мин, выбранный из группы: адренаг ЛИН, норадреналин и изопротеренол; - спиновая метка в виде стабильного иминоксильного радикала, после взаимодействия исследуемого объекта со спин-меченым биогенным амином регистрируют первый спектр электронного парамагнитного резонанса полученного состава, затем тот же состав подвергают взаимодействию с нативным биогенным амином и регистри руют второй спектр электронного пара магнитного резонанса полученного нового состава, после чего по разности амплитуд второго и первого спектров судят о количестве адренорецепторов в исследуемом объекте. Пример 1. Количественное определение i-адренорецепторов. Образец миокарда кролика подвергают гомогенизации при . 1,8 мг спин-меченого норадреналина растворяют в 0,5 мл трис-НСЁ буфере, рН 7,05. К этому раствору прибавляют 5 мг гомогенизата и инкубируют при 37°с 10 мин. Затем полученное со единение промывают трижды по 5 мл ох лажденным трис-ПСб буфером (рН 7,05) и промытый состав Переносят в стеклянную ампулу, мпулу помещают в резонатор спектрометра электронного парамагнитного резонанса и регистрируют первый спектр, амплитуда которо го характеризует количество неспецифически связанного с сопутствующими белками исследуемого объекта спинмеченого норадреналина. После этого, используя колибровочный график заиисимости амплитуды спектра от концентрации спин-меченого норадреналина рассчитывают количество неспецифически связанного спин-меченого норадреналина. Затем к гомогенизату, на хбдящемуся в ампуле, прибавляют 5 мкл трисна буферного раствора, рН 7,05, содержащего 0,5 мг нативного (битартрата) норадреналина и повторно инкубируют при 37°с в течение 10 мин. При этом молекулы нативного (немеченого) норадреналина вытесняют в раст вор молекулы спин-меченого норадрена лина, поскольку обладает большим сродством к адренорецепторам. Далее регистрируют второй спектр электрон ного парамагнитного резонанса и по колибровочному графику определяют количественное значение суммы специ фически и неспецифически связанного норадреналина. Сравнивая первое и второе измерение определяют количес во специфически связанного адреноре цепторами спин-Меченого норадренали .на. Это значение соответствует 3,4tO,3 мкм/мг гомогенизата и харак теризирует количество биологически активных адренорецепторов. Пример 2. Количественное определение гь-адренорецепторов. Образец миокарда кролика подвергают гомогенизации при . 1,5 мг спин-меченого иэопрот.еренола растворяют в ,0,5 мг буфере, рН 7,05. К этому раствору прибавляют 5 мг 1юмогеииэата и инкубируют при 10 минут. Затем гомогенизат промывают трижды по 5 мл охлажденным трисНС8 буфером (рН 7,05). и переносят в стекляиную ампулу. Ампулу помещают в резоиатор спектрометра электроиного парамагнитного резонанса и регистрир5лот первый спектр. Затем к гомогенизату, находящемуся в ампуле, прибавляют 5 мкл трис-НСК буферного раствора, рН 7,05, содержащего 0,3 мг нативного гидрохлорида изопротеренола и повторно инкубируют при в течение 10 мин. Ампулу снова помещают в резонатор спектрометра электронного парамагнитного резонанса и снимают второй спектр. По калибровочному графику, исходя из амплитуды второго спектра, определяют количественное значение суммы специфически и неспецифически связанного спин-меченого изопротеренола. По амплитуде первого спектра, используя калибровочный график, определяют количество неспецифически связанного спин-меченого изопротеренола. Затем по разнице между вторым и первь измерениями рассчитывают количество специфически связанного ft-адренорецепторами спин-меченого изопротеренола. Полученные результаты сведены в таблицу. Среднее количество специфически связанного спин-меченого изопротеренола равно 2,83 мкг/мг. Эта величина характеризует количество fb-адренорецепторов в образце миокарда кролика. Выбор того или иного биогенного амина и спии-мечекого биогенного амииа для использования зависит от типа определяемых адренорецепторов и дик гуется способностью взаимодействия с ними. Этой же причиной определяется количество исходных компонентов, участвующих в реакциях, которое для каждого конкретного случая использования способа может быть различным и выбирается различным пу- тем. Предлагаемый способ обладает hoвыыенной точностью определения, посколь.ку используеГЛые спин-меченые биогенные амины являются cтaбильны ш химическими соединениями, в которых метка .присоединена ковалентио, что

позволпет провести точное определение с ломощыэ спектрометрии электронного парамагнитного резонанса. Этим же фактором обусловлена и повьлиенная информати; ность о состоянии клеточных мембран биологического объекта,5 поскольку чем точнее определено коНомер образца Количество специфически связанно2,8 2,9 2,8 2,8 го спин-меченого изопротеренола, мкг/мг Формула изобретения Способ количественного определения адренорецепторов в клеточных мем бранах, включающий взаимодействие ис следуемого объекта с меченым биогенньал амином, а затем с немеченым соединением иной химической структуры и сравнение результатов.специфическо го и неспецифического связывания меченого биогенного амина с иссЛедуемым объектом, отличающийс я тем, что, с целью повышения точ ности, информативности и интенсификации способа, в качестве меченого биогенного амина используют спиигмеченый биогенный. амин общей формулы К - биогенный амин, выб ранный из группы: адреналин, норадреналив и изопротеренол;

личество адренорецепторов, тем больше информации можно получить-о состоянии симпато-адреналовой системы организма. Кроме того, время анализа сокращается с 2 ч до 30 мин, а также способ позволяет снизить расход биологического материала.

10 Т 2,7 2,8 2,9 2,9 2,8 2,9 О- спиновая метка в виде стабильного иминоксильного радикала, после взаимодействия исследуемого объекта со спин-меченым биогенным амином регистрируют первый спектр электронного парамагнитного резонанса полученного состава, затем тот же состав подвергают взаимодействию с нативным биогенным амином и регистрируют второй спектр электронного парамагнитного резонанса полученного нового состава, после чего по разности амплитуд второго и первого спектров судят, о количестве адренорецепторов в исследуемом объекте. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Brain Research, 1978, 159, p. 125-135.