Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 C12Q1/34 

(5) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МОНОГЛИЦЕРИДЛИПАЗЫ

Изобретение относится к области анализа ферментных реакций- и может быть использовано при определении активности моноглицеридлипазы в био логических средах, в частности для диагностики заболеваний кишечника, когда меняется активность этого фермента в слизистой оболочке кишечника, его содержимом и кале, и в научно-исследовательских лабораториях при экспериментах на животных. Известен способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы (моноглицеридгидролаза) а слизистой оболочке тонкого кишечника, включающий приготовление пробы, ферментативный гидролиз липидного субстрата под действием ферментов испытуемой пробы, экстракцию жирных кислот, освободившихся при гидролизе и определение ферментативной акт вности моноглицеридлипазы по количест ву освободившихся в единицу времени жирных кислот титрованием щелочью. Величину активности моноглицеридлипазы рассчитывают, исходя из количества освободившейся в единицу времени олеиновой кислоты 1. Недостатками данного способа определения активности оноглицеридлипазы является его низкая чувствительность и точность, сложность технологии анализа, .а такжеНевозможность определять активность в содержимом кишечника и кале. Низкая чувствительность обусловлена тем, что для проведения анализа требуются большие количества ткани кишечника (целые его сегменты до 1-2 г массой) и необходимостью выделять из клеток микросомальную фракцию. Низкая точность обусловлена невозможностью получить стандартную эмульсию субстрата, необходимостью удалять из кишечника отмыванием панкреатическую липазу, способную гидролизировать эмульсии липидов, чтоприводит к частичной потере и моноглицеридлипазы, использованием титрометрического определения освободившейся жирной кислоты, что ,вносит дополнительную ошибку за счет субъективности определения окончания титрования.

Технологическая сложность анализа данным способом вызвана необходимостью лабораторного синтеза моноолеина, его последующего эмульгирования, выделения микросомальной фракции. Невозможность применять данный способ для определения ферментативной активности моноглицеридлипазы в содержимом кишечника и кале связана с высоким содержанием в них панкреатической липазы, которую нельзя удалить, но которая гидролизует эмульси липидов (в данном случае моноолеин). Ошибка данного способа 10-12%, а время, необходимое для выполнения анализа 10 проб - 5-6 чел.-ч.

Цель изобретения - повышения чувствительности и точности способа, а также упрощение процедуры анализа и достижение возможности определять ферментативную активность моноглицеридлипазы в содержимом кишечника и кале.

Эта цель достигается тем, что в качестве субстрата используют водный раствор диоксиэтиленсорбитанмонолаурата в концентрации 70-75 мг/мл в трис-буфере с рН 7,,5. После его инкубирования с испытуемой пробой определяют количество освободившейся лауриновой кислоты путем фотоколориметрического определения окрашенного комплекса лаурата меди с хромогенным комплексообразователем. Аксивность моноглицеридлипазы рассчитывают по количеству освободившейся лауриНовой кислоты в единицу времени на единицу массы ткани кишечника или кала.

П р и м е р 1. (концентрация субстрата 7 мг/мл трис-буфера рН , 0,1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки тонкого кишечника крысы в 10 мл воды) смешивали с 1 мл раствора диоксиэтиленсорбитанмонолаурата (концентрация 70 мг/мл)в трис-буфере с рН 7,0, инкубировали 10 мин при З7с,добавляли 7 мл смеси хлороформа с ге птаном (в соотношении 3:2), встряхивали k-S мин, добавляли 3,5 мл медного реактива (5 мл 1 М уксусной кислоты, 7,6 мл триэтаноламина, 2,38 г азотнокислой меди, 60 мл воды, рН 8,3),

встряхивали 0,5 мин, из верхней фазы отбирали 3 мл и добавляли 0,5 мл хромогенного комплексообразователя (диэтилдитиокарбамат 1 мг/мл в смеси н-бутанола и хлороформа в соотношении 3:2), окрашенный раствор фотоколориметрировали при 35 нм. Определяли количество лауриновой кислоты, освободившейся при ферментативном гидролизе субстрата, по калибровочной

0 кривой.

Контрольная проба. Испытуемую пробу добавляли после 10 мин инкубирования при 37 субстратного раствора и добавление 7 мл смеси хлороформа с

5 гептаном. Активность выражали в мкмоль лауриновой кислоты, освободившейся при фрементативном гидролизе субстрата в мин на 1 т слизистой оболб)чки тонкого кишечника. Результат 035,3 мкмоль/мин.г.

Пример 2.(концентрация субстрата 72,5 мг/мл в трис-буфере рН 8,0), 0,1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки ки5шечника в 10 мл воды) смешивали в 1 мл раствора диоксиэтиленсорбитанмонолаурата (концентрация 72,5мг/мг в трис-буфере с рН 8,0, инкубировали 10 мин яри 37°С,добавляли / мл

0 смеси хлороформа с гептаном (в соотношении 3:2), встряхивали k-S мин, добавляли 3,5 мл медного реактива ,(5 мл уксусной кислоты, 7,6 мл триэтаноламина, 2,38 г азотнокислой меди, 60 мл воды, рН 8,3) встряхивали 0,5 мин, из верхней фазы отбирали 3 мл и добавляли 0,5 мл хромогенного комплексообразователя (диэтилдитиокарбамат 1 мг/мл смеси н-бута0нола и хлороформа в соотношении 3:2), окрашенный раствор фотоколориметрировали при k3S нм. АКТИВНОСТЬ моноглицеридлипагы рассчитывали пО количеству освободившейся при ферментативном гидролизе субстрата лауриновой кислоты, определяемого по калибровочной кривой.

Контрольная проба. Испытуемую пробу добавляли после 10 мин инкубиро0вания субстратного раствора при и добавления 7 мл смеси хлороформа с гептаном. Активность выражали в мкмоль освободившейся лауриновой кислоты в мин на 1 г слизис5той оболочки тонкого кишечника. Результат - 38,1 мкмоль/мин.г,

П р и м е. р 3. (концентрация субстрата 75 мг/мл в трис-буфере рН 8,5), 0,1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки тонкого кишечника крысы в 10 мл воды) смешивали с 1 мл раствора диоксиэтиленсорбитанмонолаурата (концен рация 75 мл/мл) в трис-буфере рН 8,5, инкубировали 10 мин .при , добавляли 7 мл смеси хлороформа с гептаном (в соотношении 3:2), встрЯ хивали t-5 мин, добавляли 3,5 мл ме ного реактива (5 мл уксусной кислоты , 7,6 мл триэтаноламина, 2,38 г азотнокислой меди, 60 мл воды, рН 8,3), встряхивали 0,5 мин, из верх ней фазы отбирали 3 мл и добавляли 0,5 мл хромогенного комплексообразо вателя (диэтилдитиокарбамата 1 мг/м смеси н-бутанола и хлороформа в соотношении 3:2), окрашенный раствор фотрколориметрировали при «35 нм. Активность моноглицеридлипазы рассчитывали по количеству освободи Л1ейся при ферментативном гидролизе субстрата лауриновой кислоты, определяемого по калибровочной кривой. Контрольная проба. Испытуемую пр бу добавляли после инкубации субстратного раствора 10 мин при и добавления смеси хлороформа с гепта ном. Активность выражали в мкмоль ос вободившейся лауриновой кислоты в мин на 1 г слизистой оболочки тонкого кишечника. Рез.ультат 37,6 мкмоль/мин.- г. Предложенный способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы имеет высокую чувствител ность (в 50 раз выше, чем в известном способе по количеству требукхцейся для анализа ткани), а также и по минимальной определяемой активнос ти фермента. Это позволяет определять активность моноглицеридлипазы в малых образцах проб, а Также в кале. В предлагаемом спбсобе отсутствует гидролиз используемого субстрата панкреатической липазой. Это свидетельствует о его точности (специфичности) - присутствие панкреатической 36 липазы в испытуемых объектах не искажает результаты анализа. Ошибка способа 5-6%. Предлагаемый способ обладает технологической простотой и в 2-3 раза более высокой производительностью, чем известный способ. Для проведения анализа 20 проб требуется 3 чел.-ч. Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы (в кале, содержимом кишечника, биопсийных образцах слизистой оболочки кишечника)может быть применен для клинико-диагностических лабораторий при диагностике заболеваний желудочно-кишечного тракта (ферментативная недостаточность, воспалительные процессы и др.). Формула изобретения Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы, включающий приготовление пробы,ферментативный гидролиз липидного субстрата под действием ферментов испытуемой пробы, экстракцию жирных кислот, освободившихся при гидролизе, и определение ферментативной активности моноглицеридлипазы по количеству освободившихся в единицу времени жирных кислот, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения и упрощения способа, в качестве субстрата используют раствор диоксиэтиленсорбитанмонолаурата в концентрации 70-75 мг/мл в трис-буфере в рН 7,5-8,5, а количество освободившейся лауриновой кислоты определяют фотоколоримет-рически в виде окрашенного комплекса лаурата меди с хромогенным комплексообразователем. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. J. Biol Chem. 1966, v. , p. 2306.