Способ выявления сериновых протеаз в слезной жидкости при хронических язвах роговой оболочки глаза Советский патент 1991 года по МПК G01N33/487 G01N33/74 

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, а именно к способам диагностики ферментных факторов, способствующих развитию хронических язв роговой оболочки глаза.

Целью изобретения является повышение точности и ускорение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Отобранные у больных образцы слезной жидкости (50 - 70 мкл) помещают в пластиковые пробирки с герметически закрывающимися крышками и хранят до исследования при -20°С. Допустимо одноразовое замораживание и оттаивание образцов.

Затем в 5 - 10 мкл слезной жидкости определяют общую активность ферментов,

расщепляющих этиловый эфир М-а-бензоил- аргинина (БАЭЭ-эстеразную активность) Для этого образец помещают в кварцевую спектрофотометрическую кювету, забуфе- ривают 0,1 мл 0,5М трис-HCI буфера, рН 8,0 и доводят обьем до 2 мл подогретым до 37°С 0.05М трис-HCI буфером, рН 8,0. После этого в кювету добавляют 1 мл 1,5 х 10 М раствора этилового эфира N-a -бензоил-аргинина (БАЭЭ) и начинают измерять прирост оптической плотности при 253 нм при 37°С. При отсутствии активности обьем пробы следует увеличить. Оптическим контролем служит проба, содержащая 2 мл 0,05 М трис-HCI буфера, рН 8,0 и 1 мл субстрата.

Расчет активности проводят по формуле

о со о

jCJ

ел о

ДА 2.73

t-v

где ДА - прирост оптической плотности за время регистрации,

2,73 - пересчетный коэффициент, учиты- вающий разницу молярных экстинций субстрата и продукта реакции; t - время регистрации оптической плотности; v - объем исследуемого образца, мл. Анализ действия ингибиторов на БАЭЭ-эстеразную актив- ность слезной жидкости производят следующим образом.

Готовят растворы ингибиторов: ингибиторы трипсина из бобов сои -ИТС (2 мг/мл), Ј-аминокапроновая кислота - е -АКК (20 мг/мл). В качестве тканевого ингибитора протеолитических ферментов используют коммерческие препараты Гордокс (Гидеон Рихтер, Венгрия).

К 5 - 10 мкл образца слезной жидкости добавляют 0,1 мл 0,5 М трис-HCI буфера, рН 8,0, и 0,1 мл одного из ингибиторов. Через 15 мин инкубации объем пробы доводят до 2 мл подогретым до 37°С 0,05 М трис-HCI буфером и после внесения 1 мл 1,5 х 10 3М раствора БАЭЭ начинают измерять БАЭЭ- эстеразную активность. Регистрацию оптической плотности пробы проводят каждые 3 мин в течение 9-15 мин. Расчет активности ведут по той же формуле, после чего рассчи- тывают ингибирование в процентах.

Повторяют измерение с другими ингибиторами по приведенной схеме

Исходя из подавления общей БАЭЭ-эсте- разной активности ингибиторами, устанавли- вают соотношение между активностью плазмина, тканевого и плазменного каллик- реинов и других протеиназ.

Данные о действии применяемых ингибиторов приведены в таблице

Пример 1. Обследован 21 больной с диагнозом хроническая язва роговой оболочки глаза, из них - 12 женщин и 9 мужчин в возрасте от 45 до 68 лет

Общая БАЭЭ-эстеразная активность колеблется в значительных пределах от 0,012 до 3,03 мкмоль/мл ел.ж. Доля активности, чувствительная к действию г-АКК, варьирует в отдельных образцах от 9 до 90%. что свидетельствует о различной активности плазмина в образцах. Доля активности, чувствительная к действию ИТС, варьирует в исследованных образцах от 43 до 74%, что доказывает факт неодинакового содержания в слезной жидкости больных тканевого кал- ликреина и активаторов плазмина Препарат трасилола, аналог Гордокса подавляет активность на 80 - 100%, что также свидетельствует о разном содержании в слезной жидкости больных активаторов плазмина.

Пример 2. Проведено обследование больной с диагнозом; кератит герпетический, вторичная язва роговой оболочки. К 5 мкл слезной жидкости больной добавляли 0,1 мл 0,5М трис-HCI буферного раствора, рН 8,0, доводили объем до 2 мл подогретым до 37°С 0,05 М трис-HCI буфером, рН 8,0, добавляли 1 мл субстрата (БАЭЭ) и измеряли увеличение плотности пробы на спект- рофтометре Хитачи У-3200 при длине волны 253 нм. Отсчеты оптической плотности производились автоматически каждые 3 мин в течение 9 мин. Оптическая плотность возрастала за 9 мин на 0,025, что соответствовало активности 1,57 мкмоль БАЭЭ в мин на 1 мл образца.

0,1 мл раствора е-АКК добавляли к 5 мкл слезной жидкости, забуференной 0,1 мл 0,5 М трис-HCI буфером инкубировали 15 мин при 37°С, после чего измеряли оставшуюся БАЭЭ-эстеразную активность. Активность после действия е-АКК составляет 1,43 мкмоль/мин на мл (заингибировано 8,9%), активность после действия ИТС -0.41 мкмоль/мин (заингибировано 73,9%), гордокс полностью подавляет активность образца. Следовательно, активность плазмина в образце слезной жидкости составляет около 10%. а активность тканевого калликреина - более 25% Вывод для лечения могут быть рекомендованы ин- стилляции гордокса и хелирующих агентов.

Пример 3 Проведено обследование больного с диагнозом хроническая язва роговой оболочки

Общая активность слезной жидкости - 3,03 мкмоль/мин на мл f-AKK подавляла активность на 78%, а ИТС - на 73%. Вывод: для лечения могут быть рекомендованы ин- стилляции раствора -АКК и хелирующих агентов.

Способ является количественной методикой измерения активностей ферментов, в отличие от способа-прототипа, ограничивающегося полуколичественным методом (измерение диаметра пятна и пересчет активности по калибровочной кривой), а также позволяет измерить активность тканевого и плазменного каллекреинов, что увеличивает точность метода.

Предложенный способ значительно ускоряет измерение протеолитической активности слезной жидкости с 24 - 48 ч до 9 15 мин.

Формула изобретения Способ выявления сериновых протеаз в слезной жидкости при хронических язвах роговой оболочки глаза, включающий определение протеолитической активности плаз- мина и его активаторов по расщеплению субстрата, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, протеолитическую активность определяют спектрофотометрически по скорости расщепления синтетического

субстрата этилового эфира- N - а-бензоил- аргинина, после чего измеряют остаточную активность в присутствии е-аминокапроно- вой кислоты, ингибиторов трипсина из бобов сои или гордокса, и определяют относительное содержание плазмина, его активаторов, тканевого и плазменного кал- лекреинов.

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для определения сериновых протеаз в слезной жидкости при хронических язвах роговой оболочки глаза. Цель изобретения заключается в ускорении и повышении точности определения протеаз в слезной жидкости. Сущность изобретения состоит в том, что протеолитическую активность исследуемого материала определяется спектрофотометрически по скорости расщепления синтетического субстрата э ги- лового эфира N-« -бензоил-аргинина, после чего измеряется остаточная активность в присутствии специфических ингибиторов сериновых протеаз: с-аминокапроновой кислоты, ингибиторов трипсина из бобов сои или гор- докса, и определяется относительное содержание плазмина и его активаторов, а также тканевого и плазменного каллекреинов по уровню остаточной активности. Способ ускоряет измерение протеолитической активности с 24-48 ч до 9-15 мин и позволяет количественно определять активности плаз- мина и его активаторов, а также тканевого и плазменного каллекреинов. 1 табл (Л С

Чувствительноть отдельных ферментов к действию ингибиторов