Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/92 C12N11/00 

Изобретение относится к способа получения имглобилизованной глюкозоизомеразы и может найти применение для получения активных и доста точно стабильных препаратов глюкоэоизомеразы, используемой для конверсии глюкозы во фруктозу. Известен ряд способов получения иммобилизованной глюкозоизомеразы, связанной С носителями как неорганической природы, так и органическ ( ионообменные синтетические смолы и производные целлюлозы). Однако для известных способов характерна недостаточная стабильность получаемых лродуктов, а такж необходимость добавления ионов кобальта и магния во фруктозный сиро перед конв.ерсией для активирования фермента и последующая ионообменна очистка целевого продукта. Известен также способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы путем связывания фермента с диэтил аминоэтилцеллюлозой fl. Наиболее близким к предлагаемом по технической сущности является способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы, включающий обраб ку клеточного концентрата - культу ральной жидкости Bacillus coagutan предварительно сконцентрированной до содержания сухого вещества 3-30 вес.% и подвергнутой гомогени зации до разрушения 25-100% содержащихся в ней клеток раствором глутарового альдегида в количестве 0,01-1 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества в клеточном концентрате, выдерживание полученной смеси до образования геля и удаление из геля избыточной влаги с последующей заморозкой и измельчением продукта 2. Недостатком известного способа является невысокая активность и падение ее в процессе эксплуатации ферментного препарата. Целью изобретения является повышение стабильности и активизации иммобилизованной глюкозоизомеразы. Указанная цель достигается спосо бом получения шлиобилйзованной глюкозоизомеразы, заключающимся в обработке клеточного концентрата культуральной жидкости Bacillus coagulans, предварительно сконцентр рованной до содержания сухого вещес ва 3-30 вес.% и подвергнутой гомогенизации до разрушения 25-100% содержащихся вней клеток раствором глутарового альдегида в количестве 0,01-1 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества в клеточном концентрате, вьадерживании полученной смеси до образования геля, удалении из геля избыточной влаги, npH4eMjB полученный обезвоженный гель вводят Оа, 1-0,5 ве водорастворимой соли жед;1еза в твердом виде и 1 вес.% окиси , магния в расчете на сухое вещество обезво- женного геля с последующей экструзией и сушкой экструдата в псевдоожиженном слое. Ё качестве соли железа используют сульфат железа fill) или аммонийцитрат железа (111), или цитрат железа (illl, или Пирофосфат железа Clll,, или сульфат железа (II), или лактат железа (II). Для активизации и стабилизации иммобилизованной глюкозоизомеразы в процессах конверсии глюкозы нецелесообразно соль железа вводить в глюкозный сироп., что требует дополнительного контроля за работой дозаторов, поскольку способност энзима связывать железо либо незначительна, либо очень ограничена, точка насыщения достигается в течение длительного периода процесса изомеризации. В любом случае утечка железа в продуктовый поток может происходить в любой точке процесса. Присутствие железа в продукте вызывает окраску в такой степени, что . требуется I его очистка, например, ионообменом, что удорожает стоимость очистки. Прелараты клеточной массы изомеразы глюкозы могут связывать значительные -количества железа, причем сравнительно небольшое количество железа теряется при длительном контакте с глюкозой и глюкозофруктозньам сиропом. Количество хселеза, вводимого в препараты клеточной массы, соответствует необходимому для активации и стабилизации фермента количеству.( Термин клеточная масса, препарат клеточной массы и порошок клеточной массы применяются для определения формы, препарата и частиц, получаемых, формуемых или изготовленных из вещества клеток микроорганизмов вместе с органическими реагентами, например глутарельдегидом, протеиновыми и агломеризующими агентами, например полиэлектролитами. Кроме того, улучшение производительности и/или стойкости глюкозоизомеразы может происходить если другие твердые ингредиенты также подмешиваются к энзимному препарату. Начальное падение рН, происходящее в течение 1-2 дн после загрузки колонки свежим;препаратом, вызывает ряд трудностей. Уменьшение рН в колонке нежелательно, поскольку оно вызывает сокращение активного энзимного слоя, т.е. падение активности. Введение 1% по весу окуси магния на сухое вещество изомеразы глюкозы

В препарат клеточной массы способствует преодолению начального падения рН в значительной степени; таким образом получают сравнительно стойкие величины рН сиропа. Кроме того, можно добавлять твердую глюкозу (, моногидрат глюкозы , которая служит разба ительной добавкой препарата клеточной массы, в количестве 2-15% по весу сухого вещества

Водорастворимую соль железа смешивают с окисью магния и глюкозой, а Затем добавляют к клеточной массе перед экструзией, которая дает готовый гранулят .

Активность. Единица активности представляет собой количество энзима, которое Образует фруктозу при

начальном расходе 1 мкмоль фруктоз в минуту при данном наборе усложни изомеризации.

Айализ активности. Активность определяют при следующих условиях: ,сироп - 40% по весу растворенной . декстрозы; рН на входе 8,5j jyig 0,004 м; температура , диаметр колонки 2,5 см; высота ко;лонки 35 см. Направление потока сверху вниз. Активность выражают в единицах IG 1C/1 г вещества.

Производи.тельность. Производительность дается в кг декстрозы (сухое вещество), превращенной в смесь 45% фруктозы и 55% глюкозы на 1 кг энзима, через определенное время изомеризации. В примерах производительность рассчитана пЬ указанному уравнению после времени изомеризации 2Y TлJ2.

Железо. Содержание железа определяется по 6-фенантролиновому методу

Окраска. Окраску определяют по

методу CIRF

Стойкость окраски. Стойкость окраски определяют через 1 ч при при рН 4,2 VC1R F}. Используютокись магния тяжелого типа ER/B фирма Фармелко, Милан, Италия.,

Пример 1. Добавление цитрата железа (111), лактата железа (11 и сульфата железа (1TI) в сочетании с MqQ и декстрозой.

Добавление окиси железа (111).

1550 л культурального бульона после ферментации иэомеразы глюкозы вырабатываемой Bac.coagufans, концентрируют йутем центрифугирования при до получения отстоя, содержащего около 12 г сухого веса . (); на 100 мл концентрата. .

12 г образовавшегося отстоя гомогенизируют с целью освобождения энзима путем распада клеток. При рН около 7,5 его откачивают через гомогенизатор.

Падение давления составляет 300-350 кг/см. Гомогенат практичес ки целиком активный в растворимой

форме подвергают флокулированию с помощью 30 мл/л 50%-ного раствора . Дрюорлок ЕС25, а затеям реакции с 40 мл/л раствора 5р%-ного глутарового альдегида для получения концентрации около 2% глютарового ашьдегида в растворе. .После реакции в те- чение 1 ч образовавшийся гель измельчают механическим способом, разводят в 20 л обессоленной вода и фильтруют. Осадок из фильтра продувают сжатым воздухом с целью удаления свободной воды. Осадок гранулируют на качающемся грануляторе, снабженном сеткой с отверстиями 1 см. Грубый гранулят содержит 75% воды ( определяют сушкой при 10 5° С). Гранулят делят на партии:

A.8,5 кг грубого гранулята экструдируют осевым экструдером, снабженным сеткой с отверстиями 0,8 мм. Экструдат сушат в кипящем слое воздухом при бО-бЗ С до влажности 10%.

B.К 8,5 кг грубого гранулированного осадка добавляют смесь 20 г MqO, 85 г моногидрата декстрозы

и 40 г цитрата железа (III) и с содержанием Fe 16%. После тщательного смешения смесь экструдируют и сушат как в партии А. Содержание МдО 0,98%, железа 0,31%,

C.8,5 кг грубого гранулята смешивают со смесью 20 г МдО, 85 г моногидрата декстрозы и 30 г сульфата железа (.HI) с содержанием железа 20%. После тщательного перемешивания , смесь экструдируют и сушат

как в партии А. Содержание МдО 0,98% железа 0,37%. ,

Д. 8,5 кг грубого гранулята смешивают со смесью 20 г МдО, 85 г моногидрата декстрозы и 30 г сульфата железа (III) с содержанием железа 20%. После тщательного перемешивания смесь зкструдируют и сушат как в партии А. Содержание МдО 0,98% железа 0,29%.

Полученные препараты просеивают до 0,35 - 1 мм и анализируют-. Величину рН определяют в выходящем сиропе в пробах, отобранных через, 20 и 43 ч, соответственно. Перед определением рН пробы охлаждают до 25°С. ;Результаты приведены в табл. 1

Пример 2. Добавление цитрата железа (11Т), пирофосфата железа (III), амглониПцитрата келеза (111) и сульфата железа (11.

Грубогранулированный осадок с фильтра с 76% воды, как в примере 1 разделяют на шесть партий по 8,5 кг

A.8,5 кг осадка экструдируют

и сушат как в примере 1 и получают эталонную композицию.

B.К 8,5 кг грубого гранулята добавляют . смесь 25 кг МдО, 25 г цитра:та железа с 16% железа и 250 .,г моногидрата декстрозы. После перем шивания гранулят экструдируют и су как в парт.ии Л. Содержание МдО1,23 железа 0,20%, C.8,5 кг гранулята экструдирую и сушат как в партии Л после добав Ленин 25 г МдО, 50 г цитрата железа (III) и 250 г моногидрата декст зы. Содержание МдО 1,23%, железа 0,40%. D.8,5 кг грубого гранулята обрабатывают как в партии С, но 50 г цитрата железа (1Т1) заменяют 30 г пирофосфата железа Cltl; с 12% жел за. Содержание МдО 1,23%, железа 0,18%. E.К 8,5 кг грубого гранулята добавляют 25 г МдО, 0,250 г моноги рата декстрозы и 30 г аммонийцитра та железа (III с 15% железа. Посл перемешивания гранулят экструдирую и сушат как в партии Л. Содержание МдО 1,23%, железа 0,22%. F. К последней партии в 8,5 Ткг добавляют 26 г МдО, 250 г моногидрата декстрозы и 30 г сульфата железа (II) и 30% железа. После тщательного перемешивания гранулят экструдируют и сушат в партии А. Содержание МдО 1,23%, железа 0,44% Высушенные препараты просеивают до размера 0,35-1 мм и анализируют рН выходящего сиропа определяют че рез 20 и 43 ч. Результаты приведены в табл. 2 . Заметной разницы в активизации использовантдаш солями железа не отмечается. Пример 3. Опыты по изомеризации. Для следующих препаратов применя ют грубый гранулированный осадок с фильтра в соответствии с примером 1. В осгщке на фильтре содержится 77%.воды. 410/А ;нет добавления. 410/В: /ч/ 2 ч. по весу смеси добавляют к f 98 ч. по весу сухого осадка. Смесь содержит 100 ч. декст розы, 10 ч. МдО и 12 ч. сульфата железа (111). 410/С: ч по весу смеси добавляют к «v 93 ч. по весу сухого осадка на фильтре. Затем смеси 410/А-410/С экструдируют через сито с отверстием ,0,8 мм, сушат в кипящем слое до остаточной влажности 10%. Определяют содержание железа в готовых препаратах: 410/А 0,04%, 410В 0,08%, 410/С 0,18%. Изомеризацию ведут с веществами из препаратов 410/А, 41д/В.и 410/С при следующих условиях: сироп - 45% по весу растворенной декстрозы; рН на входе 8,4+0,1, размер колонки h 40 см) d 5,8 см, 0,0016 М, объем 1л; температура 62с, вес энзима 260 г. Энзим вымачивают 2 ч при комнатной теглпературе в указанном сиропе, но при рН 8,0, затем помещают в колонку. Получают- результаты, приведенные в табл. 3. Определяют концентрацию железа в йыходящем из этих колонок сиропе.. Результаты приведены в табл. 4. Второй комплект опытов по изомеризации проводят с веществаг м из препаратов 420/В, 410/С и 410/А при следующих условиях: сироп - 45% по весу растворенной декстрозы) рН на входе 8,4-0,1 Mg;;Hf 0,0-016 м; температура , размер колонки h 20 см; d см, объем 100 мл, вес энзима 20 г. Энзим внглачивают 1 ч при. комнатной температуре в указанном сиропе, затем загружают в колонку. Получают данные, приве- денные в табл. 5. Определяют концентрацию железа в выходящем из этих колонок сиропе. Результаты приведены в табл. 6. Определяют краску по С1R F выходящего сиропа. Результаты приведены в табл. 7. . Для определения сравнительная окраска по ClRF для трех входящих, сиропов за этот период составляет 0,019, 0,012 и 0,014. Опрзделяют стойкость окраски выходящего из трех колонок сиропа. Результаты приведены в табл. 8. Для сравнения определяют стойкость окраски входящих сиропов за этот период, которая равна 0,004, 0,002 и 0,004. . Содержание железа энзимном препарате определяют до и после его использования. Результаты приведены; в табл. 9. Из табл. 9 видно, что содержание хселеза через 900 ч больше, чем в начале опыта, что объясняется поглощением железа энзимом из поступающего сиропа. Поскольку в сироп не Добавляют железа в этих опытах, оно образуется за счет следов железа, присутствующего в растворе кристаллической декстрозы. Анализ 45%-ного по весу декстрозного сиропа на желеао показал, что его количество составляет 0,5 ч/мцн, около 0,1 ч./глпн. В течение 900 ч работы этих колонок через каждую из них, содержащую по 20 г энзима, проходит 75000 г сиропа. Если средняя концентрация 0,1 ч./млн, то общая концентрация железа в сиропе 75000 7,5 г. Это соответствует количеству железа, задержанному энзимом за время, опыта. Добавление соли железа повышает активность без ухудшения стойкости повышает производительность на 2,(1-30%. Добавление меньших количеств

MgO и соли железа как в 410/В, дает меньшее увеличение рН на выход и., производио-ельности, но и эти увеличения значительйы,.

П р и м е р 4. Сравнение двухтрехвалентного железа.

К проОам грубо гранулированного осадка на фильтре, полученного согласно примеру 1, добавляют смесь соли железа, декстрозы и MgO. Затем CMiecb экструдируют через сетку с отверстиями 0,8 мм и сушат в кипящем слое до влажн€ сти 10%. Состав и количество смеси соли железа, декстрозы и MgO указаны в табл. 10.

Анализ препаратов дал следующие содержание железа: 1 (3-403 11С 0,22%; 1 G 403 110 0,27%. Условия изомеризации: сироп - 45% по весу растворенной декс-трозы рН на выходе 8,4 ± 0,1, Мд- 6,0016 Mj температура бЭС, вес энзима 20 г, размер колонки h 20 CMj d 2,5| V 100 мм.

Энзим вымачивают 1 ч при комнатной температуре в этом сиропе и загружают в колонку.. Результаты приведены в табл. 11.

Содержанйе железа в энзимном препарате определяют до и после применения. Результаты приведены в табл. 12.

В течение опыта содерж&ние железа несколько увеличивается, что указывает н.а сорбцию железа препаратами из следов железа в сиропе декстрозы.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать активированную и стабильную в процессе использования им1лобилизованную глюкозоизомеризу.

. .Таблица

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМГЮБИЛИЗОВАННОЙ ГЛЮКОЗОНЗОМВРАЗЫ, включающий обработку клеточного концентрата - культуральной жидкости BacMtus coagulans, предварительно сконцентрированной до содержания сухого вещества 3-30 вес.%: и подвергнутой гомогенизаций до раэруше ния 25-100% содержаиихся в ней клеток раствором глутарового альдегида , в количестве 0,01-1 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества в клеточном концентрате, вьщерживание полученной смеси до образования геля и удаление из геля избыточной влаги, отличающийся тем, что, с целью активирования и стабилизации фермента, в полученный продукт вводят 0,1-0,5 вес.% водорастворимой соли железа в твердом виде и 1 вес.% окиси магния в расчете на сухое вещество обезвоженного геля с последующей экструзией и сушкой экструдата в псевдоожижен 1ом слое, 2. Способ по п. 1, отличающийся теп, что в качестве сл соли железа.используют сульфат железа (III) или аммонийцитрат железа Ш.) , или цитрат келеза

307 296 308

Сравнительный.

261 273 266 268 263

8,20

7,99 7,98 7,60 8,14 7,90

Т .а б л и ц а . 2

8,24

7,90 7,84 8,22 8,19 7,79 8,14 7,70 8,03 7,87

1293

410/А 158

1316 410/С 202 0,8 0,5 . 410/В 3,6 0,5 410/С 0,5 0,5 410/А

Таблица

1880

6,9 6,8 7,2 842

2295

7,5 7,7 843

Таблица б 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 СО,5 0,5 0,5 СО,5 Йрепарат 410/В 410/С 410/А «.« 410/В 410/С 410/А Препарат 410/В . ,410/С 410/А Препарат IlQ 403 Н 1G403 11 : Препарат

1 Q 403 11 С 290 1 G 403 11 О 274

2093

482 467 1914 Окраска сиропа по C1RF после начала опыта через О ЧЕ tBH- II мачивание; | , 24 ч 1 72 ч 0,2660,030 0,019 0,2470,036 . 0,020 0,2320,0360,022 « i M -«ii« «VH «B« «в .«...--ъ.««.и.м4 тойкость окраски сиропа .после начала опыта чербз Q . ( вание 24 ч I 72 ч 0,210,040 0,014 . 0,210,050 0,017 0,220,D44 0,017 Количество железа в колонке, содержащей 20 i; энзима, мг в начале опытаj Через 900 ч ,г...--JI-iL -J-JLiLiL-i. Соль железа Декстроза,% I Окись магния,% 1,2% сульфата1 железа (111)8. 1 1,2% сульфата железа (11)В1 . , : Таблица 11 ивность Общая дли- /Полураспад ПроиэводительlC/r тельность /т, ность , , ч опыта, ч Т а б ли. ц а 7 , Т а б л и ц а 8 . .-г LT.a б Л И Ц а. 9 1624 3642. а14 44

1 G 403 11 С

54 1 G 403 11 D

Таблица 12

52 68