Способ дестабилизации микробного сычужного фермента Советский патент 1984 года по МПК C12N9/99 

со

о

СП 4

Изобретение относится к способу дестабилизации микробного сычужного фермента.

В производстве сыра молоко свертывают для отделения творога от сыворотки. Для этих целей используют продукты, содержащие реннин, который является свертывающим молоко энзимом вьщёленньм из желудка теленка.

Известно Несколько заменителей сычужного фермента теленка, включающих известные микробные сычужнйе ферменты из Mucor miehei и Mucor pusillus iH.

Сычужный фермент, вырабатьшаемый Mucor miehei, предпочтителен в сыроварении благодаря его низкой стоимости, низкой неспецифической протеолитической активности и большому сходству с реннином в отношении чувствительности к иону кальция. Кроме того, Mucor miehei отличается стабильностью при хранении сычужного фер.мента, что объясняется его высокой термостабильностью.

Некоторые пастеризованные сыворотки используются в качестве добавок к цельному молоку, например, в виде порошка для получения обогащенного молока, например дет(;кого питания. Пастеризованная сыворотка, полученная ия сыра, изготовленного с помощью сычужного фермента Mucor miehei, имеет незначительный уровень активности сычужного фермента благодаря высокой термостабильности последнего, продуцируемого Mucor miehei.

Известен способ дестабилизации микробного сыжучного фермента посредством химической модификации, осуществляемой путем обработки сычужного фермента модифицирующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, где в качестве модифицирующего агента используют цианат калия С23

Полученный карбамилированный продукт термически менее стабилен. Однако дестабилизация карбамилированного .фермента слишком мала ().

I

.Целью изобретения является снижение термической стабильности микробного сычужного фермента.

Поставленная цель достигается тем что согласно способу дестабилизации Микробного сычужного фермента прсредством химической модификации, осуществляемой путем обработки фермента модифицирующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, в качестве модифицирующего агента используют окислитель из группы свободных галогенов - хлор, бром или иод - или их производные, в которых галоген имеет число окисления 1-3, а массовое отношение окислителя к общему содержанию белка в реакционной смеси .составляет 0,01-1,0.

Обработку микробного сычужного фермента окислителем ведут при рН 5-9 до уровня дестабилизации 5-11 С при потере активности до 50% предпочтительно до 30%, а в качестве микробного сычужного фермента используют фермент, продуцируемый Mucor miehei.

Степень дестабилизации сычужного фермента, модифицированного согласно изобретению, достаточна для удовлетворения требований, предъявляемых к использованию сыворотки, и не оказывает вредного воздействия на стабильность при хранении препаратов сычужного фермента.

В идеальных условиях фермент может быть инактивирован при соответствующей (высокой) температуре таким образом, что остаточная активность фермента уменьшается как функция времени по экспоненциальной кривой спада, т.е. характеризуется легко определяемым прлупериодом долговечности и этот полупериод является функцией температуры ). Полупериод долговечности TII-J может быть вычислен по формуле

(t,-t)1.n2

Т,

/t In Ад-ln Aj

где A . - активность фермента, измеренная после нагрева до определенной температуры за время t;, ;

А2 - активность фермента, измеренная после нагрева до той же температуры в течение времени t .

При прочих равных условиях полупериод долговечности будет тем короче, чем выше температура. Для многих ферментов изменение рН ферментативного раствора и силы, а также присутствие некоторых солей может существенно влиять на полупериод долговечности. Химическая модификация специфического фермента иызывает термическую дестабилизацию фермента, поэтому степень дестабилизации составляет п °С, если исходный (немодифицированный) и модифицированный ферменты имеют одинаковый полупериод при. N и (N-n) С соответственно. Однако значения дестабилизации в известной мере приближенные вслед.ствие приблизительного характера зна чения полупериода. Все значения дестабилизации, приведенные в этом опи .сании, измерены при рН 6,0, поскольку результаты измерений зависят от значения рН. Обычно обработка фермента согласно изобретению сопровождается потерей активности. Установлено, что по экономическим причинам дестабилизацию не следует проводить на стадии, соответствующей потере активности в среднем более 50%, предпочтительно на стадии при потере 30% и более предпочтительно при потере активности -мене 10%, Обычно дестабилизацию проводят до уровня tOC и при потере активности менее 10%. В качестве оксиляющих агентов, которые могут быть использованы в способе согласно изобретению, используют гипохлорит, например гипохлорит натрия, гипобромид, например гйпобромид натрия,свободный хлор, N-хлорсукцинимид, хлорамин-Т и трихлоризоциануровую кислоту. Окислитель должен применяться в такой концентрации,чтобы желаемая степень дестабилизации достигалась за приемлемое время, которое может исчисляться от нескольких минут до 48 ч и более в тех случаях, когда протекает не прерываемая охлаждением реакция. Если концентрация окислителя слишком мала, то дестабилизация слишком слаба, если же концентрация окислителя очень высокая, то потеря активности слишком велика. Оптимальные концентрации окислителя обычно соответствуют весовому соотношению между окислителем и общим количество белка, содержащегося в ферментном препарате, и составляет 3-30 ч. оки лителя на 100 ч. общего белка. Если препарат микробного сычужного ферме та очищен до высокой степени единичной активности, то количество окислителя может быть снижено до 1 г на 100 г общего белка. Значения рН, при которых протекает реакция, могут варьироваться в широких пределах, т.е. примерно от 3 до 10, что главным образом заивисит от окислителя. Так, например, если окислителем служит гипохлорит, то предпочтительный предел значений рН 5-9 и более предпочтительный 6-8. Температура реакции не является критической, если ее поддерживать на определенном уровне, т.е. ниже 30°С, когда стабильность фермента удовлетворительная . Однако стабильность фермента может быть повышена добавкой известных стабилизирующих белок агентов, например поваренной соли в коли-. честве 5-20% от препарата фермента, или сорбита в обычных для стабилизации ферментов количествах. Сычужный фермент, модифицированный согласно изобретению, способен производить традиционный детский сыр, по свойм качествам подобный сыру Sams и Danbo и по меньшей мере с такими же свойствами, как и соответствующий немодифицированный сычужный фермент. Операция дестабилизации может и предпочтительно должна проводиться как конечная операция получения микробного сычужного фермента. рН раствора микробного сь1чужного ферменте, готового для обычных конечных операций до введения, устанавливают на заданном уровне для обработки (например, равным 7), затем сычужный фермент смешивают, перемешивая при комнатной температуре, с раствором окислителя (3-30 ч., например 20 ч. гипохлорита на 100 ч. общего белка). Затем смесь оставляют на ч для достижения желаемого уровня дестабилизации. Реакцию можно прервать добавкой активированного угля или восстановителя, такого как сульфит натрия, после завершения соответствующего периода реакции. Дестабилизированный ферментативный продукт подвергают затем обычным конечньш операциям, т:е. фильтрации установлению рН и единичной ферментативной активности до стандартных уровней и т.д. Пример 1. Исходным материалом служит концентрат сычужного фермента (культуральная жидкость концентрируется до активности, примерно соответствующей 1%-ному раствору чистого фермента, 18%-ный раствор поваренной соли добавляется к сырому кон центрату) . Этот концеHTpiar носит название Реннилаза-46. В двух сериях пробы, включакицих по три порции (25 мп), приготовленных смешением 12,5 мп реннилазы-46 и 12.5 МП воды, устанавливают рН 7,0, 8,0 и 9,0 соответственно добавлением 1 н, NaOH и к каждой из этих смесей добавляют 0,4 мп 2,25 М раствора гипохлорита натрия (NaGlO), при этом значения рН сохраняют постоянными на указанном уровне. Первую серию, включающую три порции, помещают в холодильник на ночь (приблизительно на 18 ч). Вторую серию, включакщую три порции, оставляют при комнатной температуре на 2ч. Снижение значения рН измеряют по прошествии указанных периодов времени. Затем порции разбавляют смешением 0,2 мл смеси с 50 мп воды и одновременно устанавливают значение рН 6,0 смесью ацетата натрия и уксус ной кислоты. Влияние гипохлорита натрия на остаточную активность фермента рН приведено в табл. 1. Затем разбавленные образцы подвергают тепловой обработке при 55°С в течение 30 мин при рН 6,0, после чего измеряют остаточную активность. Влияние тепловой обработки на остаточную активность модифицированного гипохлоритом сычужного фермента приведено в табл. 2. Влияние тепловой обработки на уро вень дестабилизации фермента, модифицированного гипохлоритом, приведено в табл. 3. П р и м е р 2. Значение рН трех порций реннилазы-Аб по 150 мл в каждой устанавливают 5,0, 6,0 и 7,0 соответственно. Каждую из трех порций разделяют на три части, к каждой из которьк добавляют 0,8, 1,2 и 1,6мп коммерческого 2,25 М раствора NaOCl соответственно, при этом рН поддержи вают постоянным в указанных выше зна чениях. Эти девять образцов хранят затем при комнатной температуре () в течение 20 ч, после чего из каждого образца берут пробу (10 мл). К каждой такой пробе добавляют 0,4, 0,6 или 0,8 мл 1 М раствора Na,SOj соответственно для удаления избытка гипо хлорита, 0,2 мл обработанных таким образом проб разбавляют 50 мп воды и устанавливают рН 6,0 смесью уксусной кислоты и ацетата натрия. Разбавленные пробы с установленным значением рН подвергают тепловой обработке при 55С в течение 30 мин. Результаты дестабилизации сычужного фермента гипохлоритом в условиях рН 5,0-7,0 и t 18-20°С приведены в табл. 4. Пример 3. В 600 мл реннилазы-46 при температуре около устанавливают значение рН 6,0 4 н. NaOH. Эту порцию разделяют на 6 ч. по 100 МП в каждой. К каждой из этих 6 ч. добавляют О, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 и 2,4 мл коммерческого 2,25 М раствора NaOCl соответственно и устанавливают рН 7,0. После вьздержки окодо 15 ч примерно при добавляют 2 мп 1 М , с целью устранения избыточного гипохлорита. Добавка сульфита не изменяет стабильности сычужного фермента. Измеряют изменение активности. Пробы по 5 мл разбавляют 10-кратно 0,1 Н ацетатным буфером с рН 6,0, после чего разбавленные пробы подвергают тепловой обработке при 60°С в течение 15 мин. Определяют остаточную активность после тепловой обработки и вычисляют полупериод долговечности и дестабилизацию. Результаты представлены в табл.5. П р и м е р 4. Исходным материалом для этого примера, служит реннелаза-46 без 18% NaCl. На основе указанного исходного материала готовят пять образцов по 200 г с добавкой 0,5; 10; 15 и 20% NaCl соответственно. Устанавливают значение рН 6,0 с помощью 4 н. NaOH. От каждого из пяти образцов берут пробы по 100мл. К каждой такой пробе добавляют 1 МП коммерческого 2,25 н. NaOCl при . Затем для всех пяти проб устанавливают рН 7,0 с помощью 4 н. NaOH и хранят примерно при . По истечении времени хранения (около 20 ч) определяют изменение активности. Пробы по 5 wi разбавляют 10-кратно О,1 М ацетатным буфером с рН 6,0, после чего разбавленные пробы с установившимся значением рН подвергают тепловой обработке при 60 С в течение 15 мин. Определяют остаточную активность (не подвергнутую тепловой обработке пробу анализируют параллельно в качестве контроля). Результаты испытаний приведены в табл. 6. Пример 5. Готовят две порции смеси 25 мл реннилазы-46 и 20 г ледяной воды, устанавливают рН 7,0 с помощью 4 н. NaOH, К этим двум по циям добавляют 33 и 66 мг N-хлорсукцинимида соответственно, растворя ют в 5 мп ледяной воды, при этом рН постоянно поддерживают, равным 7,0. Через 2 ч 0,2 мл этих порций разбавляют 50 мл воды, одновременно устанавливая рН 6,0 с помощью смеси ацетат натрия и уксусной кислоты. Остаточная активность после реакции сычужного фермента с N-хлорсукцинимидом следующая: при использовании 33 мг N-хлорсукцинимида 99%, а при использовании - 66 мг - 96,5% Проводят тепловую обработку при 55 С в течение 30 мин при рН 6,0. После этого определяют остаточную активность и вычисляют полупериод долговечности и дестабилизацию. Результаты приведены в табл. 7. „, г Пример 6. Готовят раствор NaOBr (примерно 2 М), добавляя по каплям бром к 10 мл перемешиваемого 4 н. NaOH при охлаждении в ледяной бане. 25 мл реннилазы-46 смешивают с 25 мл воды и устанавливают рН 7,5 однонормальным раствором NaOH. К 25 м полученного раствора в течение часа добавляют 0,5 мл раствора гипобромида натрия, при этом поддерживают рН 7,3-7,8 добавкой 1 н. НС1. Примерно через 30 мин определяют потерю активности и термостабильность. Потеря активности около 20%, остаточная активность после тепловой обработки в течение 20 мин при и рН 6,0 составляет 14%, что соответствует полупериоду долговечности около 7 мин или дестабилизации около 8°С, Пример 7. 50 мл реннш1азыразбавляют 50 мл воды. Смесь охлаждают в ледяной бане и устанавливают рН 7,0 с помощью 1 н. NaOH. Затем вводят около О,1 г свободного хлора при этом значение рН падает до 3,8, жидкость становится мутной, а, затем прозрачной. Реакционную смесь остав 1 48 ляют на 10 мин и затем добавляют 4 МП 1 М раствора Naj SO, с целью удаления избыточного хлора. 0,2 мл пробы до и после введения хлора разбавляют 50 мп воды и устанавливают рН 6,0 смесью ацетата натрия и уксусной кислоты. Потеря активности, связанная с реакцией между сычужным ферментом и хлором, составляет 21 После нагревания обработанного хлором сычужного фермента при в течение 30 мин остаточная актив- . ность равна 63%, что соответствует полупериоду долговечности около 45 мин или дестабилизации около . Пример 8. Готовят две порции по 25 мл реннилазы-46 и 25 г ледяной воды. Устанавливают рН 7,0 4 н. NaOH. К этим смесям добавляют 60 и 120 мг трихлоризоциануровой кислоты соответственно и одновременно устанавливают рН 7,0. Через 4 ч 0,2 мл полученных смесей разбавляют 50 МП воды и одновременно устанавливают рН 6,0 смесью ацетата натрия и уксусной кислоты. Разбавленные пробы подвергают тепловой обработке при 55°С в течение 30 мин. Результаты дестабилизации сычужного фермента трихлоризоциануровой кислотной приведены в табл. 8, Пример 9. Две порции реннилазы-46 по 25 мл смешивают с 20 г ледяной воды для каждой порции и устанавливают рН 7,0 с помощью 4 н. NaOH. Затем к каждой из этих порций добавляют 70 и 140 мг хлорамина Т, растворенного в 5 мл ледяной воды, соответственно и одновременно устанавливают рН 7,0.. Примерно через 2 ч 0,2 мл каждого образца разбавляют 50 мл воды с одновременным регулированием значения рН до 6,0 с помощью смеси ацетата натрия и уксусной кислоты. Разбавленные пробы с установленным рН подвергают тепловой обработке при 55°С в течение 30 мин. Результаты дестабилизации фермента хлорамином-Т приведены в табл. 9. Пример 10. Реннилазу-46 без добавки NaCl 3-кратно разбавляют. 20 мл разбавленной реннилазы-46 доводят до рН 8,5 и охлаждают до 0°С, после чего добавляют 0,7 мл 0,05 М раствора иода в 0,25 М йодистом калии. Примерно через 15 мин устанав ливают рН 6,0 добавкой 0,1 М NaHSO. Для анализа этот образец разбавля ют и одновременно устанавливают рН 6,0 с помощью смеси уксусной кислоты и ацетата натрия. Затем образец нагревают пои в течение 30 мин. Обцая активность составила 42,6%; остаточная активность после тепловой обработки 35%, полупериод долговечности при и рН 6,0 20 мин, что соответствует дестабилизации примерно 5®С (контрольный образец дает такой же .полупериод при 65°С). Пример 11. Зг протеазы, продуцируемой штаммом микроорганизмов Mucor pusillus (питательная среда, 1:220000), растворяют в 30 мл 10%-ного NaCl и устанавливают рН 6,5 при . Добавляют 15%-ный NaOCl По 50 мкл трижды с интервалом 30 мин После перемешивания в течение 3 ч смесь ввдерживают при в течение 16 ч и затем устанавливают рН 5,0. Пробы отбирают для определения актив ности и термостабильности. В табл. 10 представлено влияние 20-часового хранения на уровень дестабилизации. Пример 12. Исходным материа лом служит реннилаза-46, в которую вместо 18% NaCl добавлено 6%. 1 л исходного материала разделяют на 4 ч по 250. мл. Температуру под держивают- и в трех частях устанавливают рН 6,5 с помощью 4 н. NaOH. К этим трем частям добавляют 1, 1,2 и 1,4 об.% 10,5%-ного (по весу) NaOCl соответственно, после чего устанавливают рН 7,5 с помощью 4 н. NaOH и пробы вьщерживают в термостате при 5С. . По истечении времени реакции (3,27 и 53 ч соответственно) отбирают 50 мл пробы от каждой из обработанных гипохлоритом натрия частей и к каждой отобранной пробе добавляют 250 мг (0,5 вес.% к объему) активированного угля. Через день после введения активированного угля пробы фильтруют и испытывают на стабильность и активность сычужного фермен та (1-е определение) Пробы после добавки гипохлорита вьщерживают при -в течение 9 дней после чего их снова испытывают на стабильность и активность сычужного фермента (2-е определение). 1 4Ш После 4-дневной вьдержки при 5С и 2-дневной при 25°С снова определяют активность сычужного фермента и вычисляют общую активность (3-е определейие). Полученные результаты сведены в табл. 11 и 12. Из табл. 11 и 12 видно, что не наблюдается существенного изменения дестабилизации или общей активности с увеличением времени реакции от 3 ч до 53 ч. Пример 13. Пять образцов реннилазы-46 по 25 мл готовят с рН 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 и 6,О соответственно. К каждому из этих образцов добавляют 0,04 г гипохлорита натрия, при этом значения рН поддерживают на указанном уровне. Образцы хранят при 5°С в течение 6 дней, после чего анализируют оста- , точную активность и термостабнльность при и рН 6,0. Результаты представлены в табл.134 Пример 14. Исходным материалом служит реннилаза-46, модифицированная в двух отношениях: культураль-ную питательную среду концентрируют до активности, соответствующей 1,6%-ному раствору чистого фермента, к неочищенному концентрату добавляют 9% NaCl. Таким образом модифицируют 5952 кг реннилазы-46 на опытной установке. Устанавливают рН 6,4 при с помощью 34%-ного NaOH и добавляют 10 кг 12,5%-ного (по объему) раствора NaOCl к ферменту. Во время этой обработки рН увеличивается до 8,0 значение рН 7,4 устанавливают посредством 37%г-иой НС1. Через 18 ч при значение рН снижают до 6,9. Затем добавляют 1% активированного угля при 4-5°С. Спустя 26 ч проводят фильтрацию через фильтр-пресс и снова измеряют дестабилизацию, после чего поверхностный слой концентрируют при пониженном давлении при и рН 6,7 и добавляют NaCl до общего содержания 18%. Полупериод долговечности конечного продукта равен 11 мин, а дестабилизация составляет 1бС. Таким образом, реализация изобретения обеспечивает снижение термической стабильности сычужного ферменгв, сохраняя ее в необходимом интервале

1109054-12

---- .«. ,р

сходное рН через Остаточная актив- . начениеность, Z

рН ,.-.

2ч t8 ч 2 ч 18 ч

7,0 6,9 6,9 86,3 83.1 8,0 7,6 7,6 86,1 81,7 9.0 8,2 8,2 78,4

Исходное Остаточная активность обзначение раэцов, Z, серии рН

. J

716,34,2

816,34,3

932,314,6 Эталон98,7

Исходное . Полупериод Т|. , Дестабилизация, €, значение мин через

рНчерез

2ч tS ч 2ч 18 ч

Таблица 1

. Таблнца2

Таблица 3

1. СПОСОБ ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ МИКРОБНОГО СЫЧУЖНОГО ФЕРМЕНТА посредством химической модификации, осуществляемой путем обработки сычуж- , ного фермента модифицирующим агентом при оптимальной температуре в водной среде, отличающийся тем, что, с целью снижения термической стабильности, в качестве модифицирующего агента используют окислитель из группы свободных галогенрв - хлор, бром или иод или их производные, в которых галоген Имеет число окисления 1-3, а массовое отношение окислителя к общему содержанию белка в реакционной смеси составляет 0,01-1,0. 2.Способ поп.1,отлич ающ и и с я тем, что обработку микробного сычужного фермента окислителем ведут при рН 5-9 до уровня дестабилизации при потере активности СО до 50%, предпочтительно до 30%. 3.Способ по пп.1,2, отличающийся тем, что в качестве микробного сычужного фермента используют фермент, продуцируемый Mucor miehei.

И.5 11,5

18,4

12 12 ft

11

11 10

Таблица 5

Т а б л и ц а 7

ПолупериДестабиОстаточод Т 1/2 ная аклизация, С тивность. долговечности, мин

41,5

23,6

10 10 15,6 26,4

70

96,5 19,2 140 77,9 8,5

Т а б ли ц а 8

93,0

35 16

9 10 81 5

Таблица 9

10 12

Таблица 10