Способ определения холестерина в биологических тканях Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

1

Изобретение относится к биохимии и может быть испрпьзовано в медицине в клинической практике и лабораториях.

Известен способ определения холестерина в биологических тканях путем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопоглощения полученной реакционной смеси Pi

Однако способ обладает недостаточно высокой чувствительностью.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что способ определения холестерина в биологических тканях осуществляют путем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопоглощения полученной реакционной смеси, из пробы экстрагируют липиды, экстракт подвергают исследованию методом инфракрасной спектроскопии в области 950-1200 и по интенсивности поглощения в области 10б5 определяют концентрацию холестерина.

Способ определения холестерина осуществляется путем проведения гидрюлиза эфиров холестерина гидрооксидом калия, экстракцией его органическими растворителями .(СС{ , CHCij ), получения сухого экстракта, прессования его в пластинки с бромидом калия и измерении интенсив- нрсти поглощения полосы в области 950-1200 см- . Концентрацию холестерина рассчитывают по формуле, выведенной на основании статистической обработки калибровочной кривой методом наименьших квадратов ШГ 41)

п - D tO.i Схлс--ТПП

0,25

где D - оптическая плотность С-0;

0,017, 0,259 - коэффициенты,полученные в результате математичес. кой обработки калибровочной кривой. Для получения калибровочной кри вой готовят серию смесей, содержащих точно взвешенное количество хо лестерина от 0,1 до 1,0 мг в 200 м КВг. Тщательно размельченной и рав номерно перемещенной смесью наполняют прессформу, изготовленную известным способом, и прессуют табле ку под вакуумом 0,1-0,2 кПа и давл нии 300 кгс/см2. Регистрируют ИК-спектр в области 900-1200 см на спектрофотометре UR-20 при скорости сканирования б см/мин,щелевой программе k. Для полосы ) С-0 10б5 см находят значение оптическ плотности по методу базовой линии. На табл.1, приведены результаты измерений оптической плотности. Таблица Значения оптической плотности С-0 холестерина (табл. КВг)

Пример 1. Количественное определение холестерина в сыворотке крови.

В пробирку со шлифом, объемом 25 мл, наливают 10,0 мл спиртовог раствора КОН (2% на 96 ) и вводят по каплям 0,5 мл сыворотки

С2)

D 1о/1

где 1о и 1 - интенсивности поглощенного и пропущенного излучения.

Расчет концентрации холестерина в сыворотке крови с учетом разбавления проводят по формуле

D + 0,017 У| 100

(3)

клс

, 0,259

где V, , V2 объем , взятый для экстракции (V,) и анализе (V2 ) ;

V, - объем сыворотки крови. Пример 2. Количественное определение холестерина в тканях печени, мышцах.

Для анализа берут г печени или другого объекта, (точная навеска), из которых, экстрагируют липиды по методу Folk. крови. Пробирку закрывают пробкой, хорошо взбалтывают и ставят на водяную баню или в термостат на 1 ч (t ). После проведения гидролиза содержимое пробирки охлаждают и прибавляют 5,0 мл ССЕ хорошо взбалтывают. Раствор переносят в делительную воронку, нижний слой, т.е. экстракт сливают в сухую пробирку. На аналитических весах точно взве шивают 200,0 мг предварительно растертого спектрально чистого бромида калия и помещают в фарфоровую чашку. Пипеткой отбирают 2,0-3,0 мл (точный объем) экстракта и выливают на КВг. Растворитель испаряют в сушильном шкафу на протяжение 10-15 мин при 70-80°С. Полученный сухой остаток хорошо растирают в той же фарфоровой чашке, полностью переносят в прессформу и пресуют. Получают прозрачную пластинку, состоящую из КВг и холестерина. Регистрируют ИК-спектр полученной пластинки (таблетки) на спектрометре UR-20 в области 950-1200 см при скорости сканирования 6 см/мин,щелевой программе k, масштабе записи 100 см /см, с компенсационной таблеткой состоящей из КВг. Интенсивность измеряемой полосы находят по методу базовой линии и вычисляют оптическую плотность по формуле 5 Всю навеску липида растворяют в 3,0 мл СНСЦ ; 0,01 мл этого раствора разделяют методом тонкослойной хроматографии (гексан, диэт иловый эфир, уксусная кислота 70 : 30 :1). Пятна дигитонилсодержащего и обще го холестерина вырезают и вымывают из них холестерин 3,0 мл . На аналитических весах точно взвешивают 200,0 мг предварительно растертого спектрально чистого бромида калия и помещают в фарфоровую чашку. Полученный раствор холестерина (3,0 мл) выливают на бромид калия. Растворитель испаряют в сушильном шкафу на протяжение 10-15 мин при уо-во с. Полученный сухой остаток хорошо рас тирают в той же фарфоровой чашке,полнос тью переносят в пресс-форму и прессуют Полученную прозрачную пластинку, состоящую из KBг и холестерина, анализируют как описано в примере 1 Расчет концентрации холестерина проводят по формуле (1). В табл. 2-k представлены результаты количественного определения холестерина в крови,тканях, сыворотке крови соответственно. Таблица2 Результаты количественного определения холестерина в крови (ИК-спектроскопия) родолжение табл.3 но холестерина /г печени холе- холестерин дигитония L° it SlS11i Таблица Ц ичественного естерина в сы(фотокалориметия) Найдено холестерина,мг/%

Таблица 3 Результаты количественного определения холестерина в тканях (ИК-спектроскопия)

0,1466

0. 0, 0,3126

Предлагаемый способ (по сравнению с клиническими методами анализа) дает возможность с большей точностью определить холестерин в биологических объектах.

Применение кристаллических образцов (аластинка КВг) создает удобство в работе и повышает чувствительность метода, что позволяет использовать для анализа меньшее количество биоматериала.

Формула изобретения

Способ определения холестерина в биологических тканях путем обработки пробы реагентами с последующим измерением светопоглощения полученной реакционной смеси, о т л и79245738

чающийся тем что, с цельюпоглощения в области 10б5 см опреповышения чувствительности способа,деляют концентрацию холестерина. из пробы экстрагируют липиды, экст-Источники информации,

ракт подвергают исследованию методомпринятые во внимание при экспертизе инфракрасной спектроскопии в облас- $ 1. Патент США К. ,

ти 950-1200 см и по интенсивностикп. G 01 N 33/16, 1975.