ШТАММ Feline coronavirus, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН И ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ПЕРИТОНИТА КОШЕК Российский патент 2005 года по МПК C12N7/00 A61K39/215 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к новому штамму feline coronavirus, используемому для контроля иммуногенной активности вакцин и изготовления диагностических сывороток и глобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к коронавирусу кошек.

Установлено, что коронавирус кошек может встречаться в двух серологически неразличимых вариантах, которые именуют FECV (кишечный вирус) и FIРV(вирус, вызывающий инфекционный перитонит). Взаимосвязь этих вариантов вируса не вполне ясна [2].

По литературным данным упоминания о болезни с характерными симптомами появились в начале 1960-х годов. Впервые инфекционный перитонит был описан в 1966 г. Wolfe и Griesemer. Исследователи предположили вирусную этиологию болезни. В 1968 г. Zook и коллеги наблюдали наличие вирионов в тканях экспериментально инфицированных кошек, но не смогли охарактеризовать возбудителя. В 1970 г. Ward определил, что вирус относится к семейству Coronaviridae (в то время недавно установленному). В 1972 г. Montali и Strandberg показали, что болезнь, вызванная коронавирусом кошек, может иметь две формы клинического проявления, названные влажной и сухой. В настоящее время инфекционный перитонит кошек встречается в большинстве стран мира.

Подробной характеристики и областей использования ни одного из выделенных штаммов коронавируса не приводится [1, 2]. В нашей стране мы не нашли сообщений о выделении от кошек штаммов feline coronavirus или закупке импортных штаммов вируса.

Целью изобретения является получение тканевого штамма коронавируса кошек, обладающего стабильной инфекционной и антигенной активностью, который может быть использован для контроля иммуногенной активности вакцин, получения специфических диагностических сывороток и глобулинов и в качестве антигена для обнаружения антител к коронавирусу кошек.

Штамм инфекционного перитонита кошек выделен в 2002 г. от больного котенка с признаками инфекционного перитонита. Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию штаммов микроорганизмов Федерального государственного учреждения “Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов. Центр качества ветеринарных препаратов и кормов”. И имеет регистрационный номер - “Багира ДЕП”.

Новый штамм feline coronavirus ВГНКИ “Багира” относится к сем. Coronaviridae, первой антигенной группе рода Coronavirus, объединяющей серологически родственные вирусы: трансмиссивного гастроэнтерита и эпизоотической диареи свиней, коронавирусы человека (229Е), собак и кошек. Представлен видом Felinae Coronavirus.

Штамм feline coronavirus ВГНКИ “Багира ДЕП” характеризуется следующими признаками и свойствами:

Морфологические свойства.

Вирионы - сферические или плеоморфные частицы диаметром 60-200 нм. Состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки с булавовидными выступами длиной 12-24 нм, образующими подобие солнечной короны.

Культуральные свойства.

Вирус размножается в перевиваемой культуре клеток CrFk (почки кошки), первично полученных альвеолярных и перитонеальных макрофагах кошки и некоторых других клетках кошачьего происхождения. В монослойных культурах клеток вызывает цитопатическое действие (ЦПД) и достигает титра 5,5 lg ТЦД 50/см³.

Антигенные свойства.

Штамм коронавируса кошек "Багира" при парентеральном введении кроликам индуцирует образование антител в титрах 7-10 log₂ (PHГA).

Вирулентность.

При внутрибрюшинном заражении кошек суспензией ткани селезенки больной кошки, содержащей вирус активностью 10^-3 ЛД 50/см³ в дозе 1 см³, клинические признаки инфекции проявляются у животных через 14-60 суток. Клинические признаки болезни могут отличаться у различных животных в зависимости от индивидуальной выраженности клеточного иммунитета. Чаще всего у животных наблюдают наиболее характерные для инфекционного перитонита кошек клинические признаки: увеличение объема живота, обусловленное скоплением асцитной жидкости, судороги, горизонтальный нистагм глазных яблок. В течение 2-6 месяцев все зараженные кошки погибают.

Стабильность основных свойств штамма.

Штамм коронавируса кошек "Багира" сохраняет стабильную инфекционную и антигенную активность на протяжении 10 пассажей на кошках.

Серологические свойства.

Активен в реакции нейтрализации со специфической сывороткой.

Гемагглютинирующие свойства.

Штамм коронавируса кошек "Багира" не агглютинирует эритроциты животных.

Безвредность для лабораторных животных.

Штамм коронавируса кошек "Багира" безвреден для белых мышей, морских свинок и кроликов при внутримышечном, подкожном и внутрибрюшинном введении.

Дополнительные сведения о штамме.

Штамм коронавируса кошек "Багира" свободен от бактериальных, микоплазменных, грибковых и вирусных контаминантов.

Способность штамма к распространению в естественных условиях.

Заражение животных в окружающей среде происходит аэрогенно и через контакт здоровых животных с выделениями больных. Инкубационный период при этом составляет от 2 недель до 6 месяцев. Возможен трансплацентарный путь заражения.

Основные условия хранения.

Штамм "Багира" коронавируса кошек лиофилизированный со стабилизирующими веществами сохраняет активность при минус 20°С 6 месяцев.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Штамм вируса инфекционного перитонита кошек "Багира" используют для изучения иммуногенной активности опытного образца вакцины. Для этого испытуемую вакцину против инфекционного перитонита кошек вводят 4 котятам 2,5-месячного возраста согласно наставлению по ее применению. Через месяц после иммунизации проводят внутрибрюшинное заражение этих, а также 4 невакцинированных котят вируссодержащей суспензией из штамма коронавируса “Багира”, содержащей вирус активностью 10^-3 ЛД 50/см³ в дозе 1 см³. За всеми животными осуществляют наблюдение в течение 6 месяцев. Учет результатов показывает, что иммунизированные котята остаются здоровыми, у них в течение всего срока наблюдения не отмечают каких-либо отклонений от нормы. Невакцинированные котята заболевают с признаками, характерными для инфекционного перитонита (увеличение объема живота вследствие скопления в брюшной полости асцитной жидкости, угнетение, судороги, горизонтальный нистагм глазных яблок) и погибают в течение срока наблюдения (12 недель). Таким образом, испытуемая вакцина является иммуногенной, а штамм feline coronavirus “Багира” может служить для контроля иммуногенности вакцины против коронавирусного перитонита кошек.

Пример 2

Специфические гипериммунные сыворотки на штамм коронавируса кошек “Багира” получают на кроликах и козах. Используют 2 способа иммунизации: еженедельное 3-кратное введение антигена (активностью 10^-3 ЛД 50/см³) в объеме 1 см³ кролику и 3 см³ козе и иммунизацию малыми дозами антигена. При втором способе антиген вводят внутримышечно в том же объеме и добавлении полного адъюванта Фрейнда (1:1), а затем через 2 месяца без адъюванта внутривенно в объеме 0,3 см³ и 0,5 см³ соответственно. Отбор крови для получения проб сывороток производят через 14, 21 и 28 дней после последнего введения антигена. Активность полученных сывороток устанавливают в РНГА. Специфичность полученных сывороток проверяют в РНГА с эритроцитами, сенсибилизированными данным вирусом и вирусом ПЛК.

При использовании различных методов гипериммунизации кроликов на всех животных получают активные в РНГА сыворотки крови. У кроликов и коз контрольной группы они являются негативными. Сыворотки крови кроликов, которым вводят антиген еженедельно, обладают активностью в РНГА 7-8 log₂, коз - 6-8 log₂. Более высокую активность в РНГА проявляют сыворотки крови, которые получают от кроликов и коз, иммунизированных малыми дозами антигена - 8-10 log₂ и 8-10 log₂ соответственно. Полученные сыворотки не проявляют активности в РНГА с вирусом панлейкопении кошек.

Гипериммунные сыворотки используют для получения глобулинов или используют в нативном виде для диагностики инфекционного перитонита кошек в серологических реакциях. Сыворотки хранят в лиофилизированном или нативном виде при температуре минус 10-18°С в течение 24 месяцев.

Пример 3

Получают глобулин из сыворотки крови гипериммунизированных коз с титром 8,0 log₂ в РНГА и кошек - с титром 8,5 log₂ в РНГА. Для этого используют общепринятый метод его высаливания насыщенным раствором натрия сульфата.

Осадок глобулина ресуспендируют фосфатным буферным раствором рН 7,2. Титр глобулина из сыворотки крови коз после ресуспендирования составляет 8,5 log₂ в РН, кошек 9,25 log₂.

Полученные глобулины используют для диагностики инфекционного перитонита кошек в серологических реакциях. В частности, они служат положительным контролем при постановке РНГА и используются в реакции нейтрализации.

Глобулины хранят в лиофилизированном или нативном состоянии при температуре минус 10-18°С в течение 24 месяцев.

Пример 4.

Сыворотки, полученные по примеру 3, или глобулины, полученные по примеру 4, используют для диагностики инфекционного перитонита кошек методом флуоресцирующих антител (МФА).

Для приготовления препарата используют мазки-отпечатки клинического материала (крови, асцитной жидкости) или патматериала (селезенки, слизистой оболочки мочевого пузыря, толстого отдела кишечника), полученные от больных кошек. Параллельно исследуют такие же пробы от благополучных по данной инфекции животных (отрицательный контроль). Мазки фиксируют на предметном стекле ацетоном в течение 20 мин (при 0°С). Затем отмывают фосфатным буферным раствором рН 7,2. На стекла наносят люминесцентную сыворотку (глобулин), приготовленную по стандартной методике. Окрашивание контрольных и зараженных клеток проводят во влажной камере, в течение 1 часа, при температуре 37°С. После этого тщательно отмывают препарат от свободного красителя фосфатным буферным раствором рН 7,2. Просматривают мазки с помощью люминесцентного микроскопа под иммерсией. Устанавливают в поле зрения характерные для данного органа (ткани) клетки с серовато-зеленоватой цитоплазмой и ядром со слабо светящимися ядрышками. В пораженных клетках отмечают яркое свечение отдельных мелких гранул в цитоплазме вокруг ядра. Клеточное ядро хорошо просматривается, но не флуоресцирует. В контрольном мазке-отпечатке из ткани или органа благополучного по инфекционному перитониту животного свечение отсутствует. Люминесцентный метод исследования позволяет установить наличие коронавируса в клетках тканей больных животных и поставить диагноз серологическим методом.

Использование в ветеринарной практике штамма feline coronavirus "Багира" ДЕП позволит с достаточной достоверностью судить о качестве изготавливаемых и используемых биопрепаратов против инфекционного перитонита кошек. Использовать антиген и полученную из него сыворотку в серологических реакциях для диагностики коронавирусной инфекции кошек.

Источники информации

1.Evermann, J.F., Baumgartner, L., Ott, R.L., Davis, E.V. and McKeirnan, A.J., Characteristics of feline infectious peritonitis virus isolate.//1981. Vet. Pathol, - 18. - P.256-265.

2. Pedersen, N.C. Feline infectious peritonitis and feline enteric coronavirus infections. //1983, - Feline Pract, - 13(4). - P 13-19.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Штамм feline coronavirus депонирован в коллекцию микроорганизмов ФГУ “Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов в 2003 году и имеет регистрационный номер “Багира”. Штамм обладает стабильной инфекционной и антигенной активностью и пригоден для контроля иммуногенной активности вакцин против инфекционного перитонита кошек, а также для изготовления гипериммунных сывороток и глобулинов, используемых при диагностике данной болезни.

Штамм Feline coronavirus ВГНКИ “Багира”-ДЕП, используемый для контроля иммуногенной активности вакцин и изготовления биопрепаратов для диагностики коронавирусного перитонита кошек.