Способ получения урокиназы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/72 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРОКИНАЗЫ

I

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения лекарственных препаратов.

Известен способ получения урокиназы путем культивирования культуры почечной ткани в жидкой питательной среде в присутствии аминокислоты с последующим выделением целевого продукта 1.

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта.

Цель изобретения - повышение выхода урокиназы.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения урокиназы путем культивирования культуры почечной ткани в жидкой питательной среде в присутствии аминокислоты с последующим выделением целевого продукта культивирование ведут в присутствии 0,3-0,5% фенилаланина.

Способ осуществляют следующим образом.

Почечные клетки выращивают в соответствующей питательной среде в сосудах для тканевых культур при до слияния клеток. Среда 199 является

g типичной, подходящей средой роста. Можно также использовать модифицированную среду EagEe по DuEbeceo, среду 5 А по McCoy, среду MB 752/1 по Waymouth и другие о&цепринятые среды

IQ для тканевых культур. Во время роста культуральную среду укрепляют сывороткой млекопитающих, например сывороткой эмбриона крупного рогатого скота, в количестве 5-15% по объему.

15 среды.

После слияния клеток их промывают физиологическим раствором, например буферным рассолом, и затем промывную жидкость заменяют консервирующим веществом.

Можно использовать водную питательную среду, которая является необходимой для сохранения почечных клеток и для получения урокиназы. Эта

25 среда содерххит гидролизат белка моло392ka, альбумин человеческой сыворотки, глюкозу и бикарбонат натрия. Кроме гидролизата белка молока, можно также использовать и другие белковые гидролизаты, такие как триптол, триптозу, пептон и другие материалы. П р и м е р 1. Нормальные первичные клетки почки человеческого эмбриона (ПЧЭ) центрифугируют и пересуспендируют в среду 199f содержащую 10% по объему сыворотки эмбриона круп ного рогатого скота. Клеточную суспензию применяют для инокуляции пласт массовых колб Фалькона емкостью 75 см |;одержащих ту же среду в количествахi достаточных для того, чтобы конечный культуры составил 15-2J3 мл, а плотность клеток 1,,ОЧО клеток на мл. Колбы инкубируют при 37°С в инкубаторе с содержанием S% СОп в воздухе. Среду в колбах меняют каждые 2-3 сут до слияния культур. Затем клетки в каждой колбе промывают 25 мл стерильного, физиологически нормального соляного раствора. После удаления промывного раствора 10 мл консервирующего вещества содержат 13,65 г/л среды гидролизата лактальбумина; 2,2 г/л NaHCO, 0,1 вес. сывороточного альбумина человека; (1,1 вес. Д-глюкозы и 0,5 вес.% фенилаланина. Из консервирующего вещества отбирают пробу для титров урокиназы и его пополняют ежесуточно 10 мл того же свежего консервирующего вещества. По истечении четырехсуточного.культивирования среДУ удаляют и клетки в каждой колбе промывают несколько раз 25 мл соляного раствора и затем 1 н. раствором NaOH. Анализ показывает, что содержание ДШ в клетках почки человеческого эмбриона составляет 9 мкг ДНК (10 эклеток ). . Анализ урокиназы производят путем двухступенчатого метода с помощью йодированной фибрином плитки. В первой стадии урокиназа действует на плазминоген с образованием плазмина. Во второй стадии плазмин гидролизует радиоактивномеченый сгущенный фибриноген (фибрин) с выделением фибринопептидрв в раствор, измеренных гаммасчетчиком. Активность урокиназы затем относят пропорционально к радиоактивности, выделенной в раствор. Единицу активности урокиназы определяют как количество энзима, который гидролизует один мгк фибрина за час. П р им е Р2. Нормальные первичные клетки почки человеческого эмбриона культивируют до слияния в колбах Т-75, как описано в примере 1, также промывают в стерильном соляном растворе и удаляют 90 мл консервирующего вещества, фенилаланин добавляют в каждую колбу. Среду пополняют свежей средой, которую добавляют в колбу объемом 30 мл каждые трое суток. По истечение девятисуточного культивирования в фенилаланине среду удаляют, клетки промывают несколько раз и определяют содержание ДНК и титры урокиназы как в примере 1. В данном примере консервирующее вещество состоит из 13,75 г/л среды гидролизата лактальбумина, 2,2 г/л NaHCOзи 0,1 вес. Д-Тлюкбзы. Аминокислоту и/или человемеский сывороточный альбумин (ЧСА) добавляют в основное консервирующее вещество для получения желательной конечной концентрации {в вес.%). Аналогично примеру 1 активность урокиназы определяют в мл на день и мкг ДНК. Сравнительные, данные по выходу урокиназы представлены в таблице.

Без добавки

0,U ЧСА

0,1 ЧСА + 0,3 глицин

0,U ЧСА 0,5% глицин

Конечное содержание ДНК в клетках в каждой колбе по истечении девятисуточного культивирования в консервирующем веществе.

Выход урокиназы, полученный куль- ткани в жидкой питательной среде в

тивированием почечных клеток при ис- 5присутствии аминокислоты с последуюпользовании повышенных количеств фе-щим выделением целевого продукта,

нилаланина в консервирующем вещест-отличающийся тем, что,

ве, в основном, выше, чем при ис-с целью повышения выхода урокиназы,

пользовании других аминокислот гли-культивирование ведут в присутствии

цина, метионина, гистидина. Это улуч-ЗО0,3-0,5 0енилала «4на. шение достигается и тогда, когда число клеток (т.е. содержание ДНК) по-Источники информации,

нижается,принятые во внимание при экспертизе

Формула изобретения

Способ получения урокиназы путем Э51- Патент США If ЭЗЗОЭ

культивирования культуры почечнойкл. .7 опублик. 1976.

Продолжение таблицы