Штамм гибридных культивируемых клеток мыши мUS мUSсULUS,используемый для получения моноклональных антител к урокиназе человека Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K39/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения,, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повышенной константой с вязывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента.

Штамм получают следующим образом.

Мышам линии Balb/c проводят 3 еже- . недельные подкожные иньекции урокиназы из расчета 30 мкг фермента на мышь.Иммунизацию проводят смесью высоко- и низкомолекулярных форм фермента. Первая иммунизация осуществляется в полном адьюванте Фрейнда, вторая и третья - в неполном. Четвертую иммунизацию проводят внутрибрю- шинно, введением 50 мкг урокиназы в физиологическом растворе за 3 сут до гибридизации. Гибридизацию проводят слиянием 10 клеток селезенки иммунных мышей с 4-10 клеток миеломы ХбЗ - Ag 8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 1500 усл. ед. После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 10 М гипоксантина, 4-10 М аминоптерина и 1,6-10 М тимидйна. Гибриды - продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке на лунку. После второго клонирования более 90% полученных субклонов продуцируют антитела к урокиназе.

Продуктивные субклоны выводят в массовую культуру и ббозначают UIG. Штамм UIG хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером ВСКК(П 35D и характеризуется следующими признаками .

Культуральные признаки.

Среда для культивирования - среда с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% ло- п адиной сыворотки, 4 мМ Ь-гл.утамина 100 ед/мл пенициллина, ТОО мкг/мл стрептомицина, 10 пирувата натрия

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

0,05% меркаптоэтанола при в атмосфере 5% CO-J . Посевная доза 10 клеток в 1 мл. Клетки пассируют раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная.

Клетки штамма иньецируют в/брюшин- но в количестве 10 кл в 1 мл среды. Игла мышам линии Balb/c, предварительно обработанных пристаном. Асцит образуется 12-16 дней. Штамм перевивается на мьш1ах не менее 3 раз.

Продуктивность штамма.

Содержание моноклональных антител в культуральной жидкости на 4 день культивирования составляет 20-30 мкг/ /мл культуральной среды, а в зрелом асците - 2-3 мг/мл асцитической жидкости.

Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.

Характеристика целевого продукта.

Моноклональные антитела относятся к классу In G , (К-) , имеют константу связывания с урокиназой человека 10 М , ин гибируют активность данного фермента, взаимодействуют с его двумя молекулярными формами.

Криоконсервирование клеток штамма.

2-10 клеток консервируют в 1 мл телячьей эмбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсульфоксида в пластиковых ампулах. Замораживание ведут по следующей схеме: снижают температуру до 4°С, а затем по 1 С в мин до -40°С. Клетки хранят в жидком азоте. Размораживают быстро при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-80%.

Использование штамма UIG иллюстрируется следунлцими примерами.

Пример 1. Клетки штамма UIG помещают в пластиковый флакон объе- мом 75 см по 5- 10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 ед/ /мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия, 0,05% меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% СО. Клетки культивируют 4 дня. Культуральную среду собирают, центрифугируют в течение 10 мин при

800 g. Супернатант тестируют на присутствие антител к урокиназе по следующей схеме: 100 мкл раствора высо- комолекулярной либо низкомолекуляр- ной урокиназы с концентрацией 10 мкг /мл вносят в ячейки полистиролового планшета для иммунологического анализа и инкубируют при 4 С в течение 12-15 ч. Затем планшет промывают 10 мМ фосфатным буфером рН 7,4, содержащим 150 мМ NaCl и 0,05%-Твин-20 (раствор А). В ячейки с сорбированной на полистироле урокиназой вносят по 100 мкл культуральной среды и ин- кубируют 1 ч при комнатной температуре, после чего отмывают от несвязавшегося белка раствором А. Специфично связавшиеся антитела выявляют с помощью меченных радиоактивным I (удельная активность 100000 имп/мин fMKr) кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, добавляя их по 2 мкг в лунку в 100 мкл раствора А. В качестве отрицательного контроля используют препарат неиммунных иммуноглобулинов мьши вместо культуральной среды штамма.

Радиоиммунологлческий анализ культуральной среды штамма UIG на присут- ствие антител к урокиназе следующий.

Анализируемый Связалось антиобразец тел кролика против иммуноглобу- . линов мыши, имп/ /мин

Культуральная среда штамма

высокомолекулярная форма

урокиназы низкомолекулярная форма

урокиназы Неиммунные иммуноглобулины

J5 0 5

Q

5

0

5

мьшш (2U мкг/

/мл) (контроль)

Результаты свидетельствуют о высокой специфичности полученных МЛ при взаимодействии их как с высоко- так и с низкомолекулярной формами урокиназы.

П р и м е р 2. 100 мл культуральной среды, полученной по примеру 1, наносят на колонку с иммобилизованными кролич-ьими антителами против иммуноглобулинов мыши, колонку промывают раствором А (см. пример 1) и злюируют специфично связавшиеся антитела к урокиназе глициновым буфером рН 2,8. Получают 2 мг препарата очищенных антител к урокиназе, которые иммобилизуют на сефарозе 4В по стандартной методике с использованием бромциана. На 100 мкл иммуносорбента, содержащего 2 мг антител/мл геля, наносят 0,5 л человеческой мочи, промывают сорбент раствором А и элюируют фермент глициновым буфером рН 2,8. Анализ содержания фермента в элюате проводят на фибриновых пластинках, содержащих плазминоген. 100 мкл иммуносорбента с 90%-ной эффективностью связывают в данных условиях всю уро- киназу, содержащуюся в моче. Конечный выход фермента, очищенного в одну стадию, составляет не менее 60%, удельная активность препарата составляет 150000 МЕ/мг, что соответствует гомогенному препарату урокиназы. Электрофорез показывает, что на иммуносорбенте выделяются и низко- и высокомолекулярные формы урокиназы.

Формула изобретения

Штамм Гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus BCKK(n)N35D, используемый для получения монокло- нальных антител к урокиназе человека.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши MUS musculus, продуцирующего моноклрнальные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повышенной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента. Штамм UIG получают гибридизацией спленоци- тов мышей линии Balb/c, иммунизированных препаратом урокиназы, с клетками миеломы X63-Ag8.653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером BCKK(n)35D и характеризуется следукнцими признаками. Среда для культивирования - среда RPMI-1640 с 10% змбриональной телячьей и 10% лошадиной сыворотки, посевная доза 10 кл. в 1 мл, кратность рассева 1:10 каждые 3-4 дня, культура суспензионная. Штамм перевивается в виде асцита на мышах линии Balb/c не менее 3 раз. Содержание МА в куль- туральной жидкости на 4 день культивирования составляет 20-30 мкг/мл, в зрелом асците - 2-3 мг/мл. МЛ отно- сятся к классу 1 G, t(K-5, имеют кон- S станту связьгоания с ант йгеном , ингибируют активность урокиназы, взаимодействуют с двумя ее молекулярными формами. МА используются для определения и очистки урокиназы. I л СлЭ 00 4 а