Штамм гибридных культивируемых клеток мыши MUS мUSсULUS,используемый для получения моноклональных антител к урокиназе человека Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K39/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующего моноклональные анти- тела (МА ) к урокиназе человека, обладаю1цие повышенной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента, Штамм получают следующим образом. Мышам линии Balb/c проводят 3 еженедельные подкожные инъекции урокиназы из расчета 30 мкг фермента на мышь. Иммунизацию проводят смесью высоко- и низкомолекулярных форм фермента. Первая иммунизация осуществляется в полном адъюванте Фрейн- да, вторая и третья - в неполном. Четвертую иммунизацию проводят внут- рибрюгаинно введением 50 мкг урокиназы в физиологическом растворе за трое суток до гибридизации. Гибриди- зуют 10 клеток селезенки иммунных мьш1ей с 4 10 клеток миеломы Х63- Ag8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол.мае.1500. После гибридиза,ции клетки высевают; в 96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. Для культивирования и се- лекции гибридом используют среду RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, гипоксантина 4-10 М аминоптерина и 1,6-10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке на лунку После второго клонирования более 90% полученных субклонов продуциру- ют антитела к урокиназе.

Продуктивные клоны вьшодят в массовую культуру и обозначают UNG. Штамм UNG хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)34Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда для культивирования - среда RPMI-I640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки,10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутами

0 5 0 с 0

0

на, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/ /мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия, 0,05% меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% COj. Посевная доза - lO клеток в 1 мл.

Клетки пассируют раз в 3-4 дня. Кратность рассева 1:10. Культура суспензионная. Клетки штамма инъецируют в/брюшинно в количестве 10 кл в 1 мл среды Игла мышам линии Balb/c, предварительно обработанным приста- ном. Асцит образуется через 12- 16 дней. JllTaMM перевивается на мышах не менее 3 раз.

Продуктивность штамма.

Содержание моноклональных антител в культуральной жидкости на 4-й день культивирования составляет 20-30 мкг/мл культуральной среды, а в зрелом асците - 2-3 мг/мл асци- тической жидкости.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и тимидиновой метке в культуральной среде.

Характеристика целевого продукта.

Моноклональные антитела относятся к классу Ig G,(K), имеют константу связывания с антигеном 10 М ин- гибируют активность урокиназы человека, взаимодействуют с двумя ее молекулярными формами.

Криоконсервирование.

2-10 клеток штамма консервируют в 1 мл телячьей змбриональной сыворотки с добавлением 10% диметилсуль- фоксида в пластиковых ампулах. Зайо- раживание ведут по следующей схеме: снижают температуру до 4 с, а затем по в 1 мин до -40°С. Клетки хранят в жидком азоте. Размораживают быстро при 37°С. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-80%.

Использование штамма UNO иллюстрируется следующими примерами.

Приме р 1. Клетки штамма UNG помещают в пластиковый флакон объемом 75 см по 5-10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки,10% лошадиной сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10 мМ пирувата натрия, 0,05% меркаптозтанола при в атмосфере 5% CO. Клетки культивируют 4 дня Культуральную среду собирают, центрифугируют в течение 10 мин при 800 g Супернатант тестир /тот на присутствие антител к урокиназе по следующей схеме: 100 мкл раствора высоко- либо низкомолекулярной урокиназы с концентрацией 10 мкг/мл вносят в ячейки полистиролового планшета для иммунологического анализа и инкубируют при А С в течение 12-15 ч. Затем планшет промывают 10 мМ фосфатным буфером iрН 7,4), содержащим 150 мМ NaCl и 0,05% Твин-20 (раствор А ). В ячейки с сорбированной на полистироле урокиназой вносят по 100 мкл культуральной среды и инкубируют . I ч при комнатной температуре, после чего отмывают от несвязавшегося белка раствором А. Специфично связавшиеся антитела выявляют с помощью меченных радиоактивным I (удельная активность 100000 иип/мин-мкг ) кроличьих антител против иммуноглобулинов мьпии, добавляя их по 2 мкг в лунку в 100 мкл раствора А. В качестве отрицательного контроля используют препарат неиммунньгх иммуноглобулинов мыши вместо культуральной среды штамма.

Результаты радиоиммунодогичеекого анализа преде г авлены в таблице .

Результаты, представленные в таб- лице, свидетельствуют о том, что полученные моноклональные антитела обладают высокой спе1 1фичностью по отношению как к высоко-, так и низко молекулярной формам урокиназы человека.

Пример2. 100 мл культуральной среды, полученной по примеру 1, наносят на колонку с иммобилизованными кроличьими антителами против иммуноглобулинов мьшш, колонку про- мьгоают раствором А (см.пример I) и элюируют специфично связавшиеся антитела к урокиназе глициновым буфером (рН 2,8 J. Получают 2 мг препарата очищенных антител к урокиназе, которые иммобилизуют на сефарозе 4В

по .т андартной методике с использо- вар1ием бромциана. На 100 мкл иммуно- сорбента, содержащего 2 мг антител/ /мл геля, накосят 0,5 л человеческой мочи, промывают сорбент раствором А и злюируют фермент глициновым буфером ( рН 2,8). Анализ содержания фермента в элюате проводят на фибрино- вых пластинках, содержащих плазмино- ген. 100 мкл иммуносорбента с 90%- ной эффективностью связывают в данных условиях всю урокиназу, содержащуюся в моче. Конечный выход фермента, очищенного в одну стадию, составляет не менее 60%, удельная активность препарата составляет 150000 МЕ/мг, что соответствует гомогенному препарату урокиназы. Электрофорез показьшает, что на иммуно- сорбенте выделяются низко- и высокомолекулярная формы урокиназы.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток мьшш Mus musculus ВСКК/П/ N 34D, используемый для получения мо- ноклональных антител к урокиназе человека .

об

Количество связанных антител кролика, имп/мин

35

Культуральная

среда UNG

высокомолекулярная форма урокиназы

низкомолекулярная форма урокиназы

Неиммунные иммуноглобулинымыщи /20 мкг/мл/ /контроль/

59001300

60001300

360140

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выделения, очистки и определения урокиназы в биологических жидкостях. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыгаи Miis mtisculus, продуцируюгчего моноклональные антитела (МА) к урокиназе человека, обладающие повьпченной константой связывания с антигеном и взаимодействующие с двумя молекулярными формами фермента. .Штамм NG получают гибридизацией спленогштов мьпией линии Balb/c, иммунизированных препаратом урокиназы, с клетками миеломы X63-Ag8-653. Он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 34Д и характеризуется следующими признаками. Среда для культивирования; среда RPMI-I640 с 10% эмбриональной телячьей и 10% лошадиной сыворотки, посевная доза 10 кл. в мл,кратность рассева 1:10 каждые 3-4 дня, культура суспензионная. 1 1тамм перевивается в виде асцита на мыиах линии Balb/c не менее 3 раз. Содержание МА в культуральной жидкости на 4 день культивирования составляет 20-30 мкг/мл, в зрелом асците 2-3 мг/мл. МА относятся к классу IgG , (К),имеют константу свя- зьшания с антигеном 10 М ,инги- бируют активность урокиназы, взаимодействуют с двумя ее молекулярными формами. МА используются для определения и очистки урокиназы. 1 табл. t (/ СО 00 ел 00

ВЮиПИ Заказ 1164/27

Ироизн.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Тираж 520 Подписное