Способ непрерывного культивирования светящихся бактерий рнотовастеRIUм рноSрноRеUм Советский патент 1982 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использойано для тестирования ряда биологически актив ных веществ. Постоянное свечение по лучаемого урожая бактерий позволяет создать биолюминесцентный датчик неп рерывного действия. Использование бактерий с постоянным уровнем люмине ценции удобно и при обычном применении светящихся бактерий для тестирования загрязнения окружающей среды, ядов и наркотиков в медицине и т.д. Оно может быть использовано и в.иикробиологической промышленности для непрерывного получения биомассы бактерий с высокой производительностью и большим содержанием люциферазы. Высокое содержание люциферазы упрощает методику очистки этого фермента. Может быть использовано в научны исследованиях при изучении связи между люминесценцией и процессами метаболизма в бактериях. Известен способ непрерывного культивирования светящихся бактерий Photobacterium belarerskii в турбидостате, где поддерживается на пос- I тоянном уровне оптическая плотность суспензии tilОднако в процессе культивирования биолюминисценция изменяется на два порйдка, т.е. активность люциферазы в клетке варьируют в 100 раз. Исполь зование такой биомассы для тестирования биологически активных веществ крайне затруднительно, а биомасса непригодна для получения, очищенных препаратов люциферазы. Известен также способ культивирования Ph. phosphoreum (СМВ 8), где подачей питательной среды и вы- водом готового продукта на постоянном уровне поддерживают совмещенный сигнал, который складывается из проходящего через культуру света от излучателя (оптическая плотность) и биолюминесценции бактерий. Соотношение между интенсивностью прошедшего через культуру света и интенсивностью биолюминесценции выбирают приблизительно равным 1:1. Питательная среда, применяемая для культивирования в момент ее добавления в культуру светящихся бактерий, должна инги бировать биолюминесценцию. Для этог используют сложную питательную сред Oxoid Nutrient Broth (СМ1), к которой добавляют глицерина 1% об./об. и 2,5% вес./об. NaCI {21, Недостатком этого способа является низкая стабильность биолюминес ценции, которая составляетt 8. Био масса получаемая при этом более удовлетворительна для получения люц феразы, но не пригодна для использования ее в качестве биолюминесцен ного датчика непрерывного действия когда требуется фиксировать изменение свечения меньше ±8%. Кроме того способ требует применения сложной аппаратуры управления процессом кул тивирования.. Цель изобретения - повышение ста бильности биолюминесценции бактерий Поставленная цель достигается те что питательную среду добавляют, когда биолюминесценция превышает за данный уровень, причем питательная среда содержит хлористый натрий фосфорнокислый натрий двузамёщенный, фосфорнокислый калий однозамещенный, фосфорнокислый аммоний двузамещенный, сернокислый магний, пеп тон и глицерин, при следующем соотношении компонентов, г/л: Хлористый натрий Фосфорнокислый натрий двузамещенныйФосфорнокислый калий однозамещенный1,0-1,1 Фосфорнокислый аммоний двузамещенный0,50-0,55 Сернокислый 0,08-0,12 магний Глицерин 1-2,5 5,0-5,1 Пептон До 1000 мл На чертеже изображено устройство применяемое для реализации предлага емого способа. Устройство состоит из термостати руемого культиватора 1, датчика био люминесценции бактерий 2, самописца с позиционным регулятором 3, насоса дозатора, подающего питательную среду в культиватор 4, резервуара с питательной средой 5 и сборника урожая 6. Термостатируемый при температуре оптимальной для роста и люминесценции бактерий культиватор заполняется питательной средой. Туда же вводится инокулят бактерий. Культивирование ведут при интенсивном перемешивании и барботаже. Интенсивность биолюминесценции и количество клеток увеличивается. После достижения заданного уровня люминесценции с помощью позиционного регулятора включается насос-дозатор, подающий питательную среду в культиватор. Одновременно эквивалентный объем культуральной жидкости со светящимися бактериями сливается в сборник урожая. После разбавления культуры и уменьшения интенсивности биолюминесценции, контакты позиционного регулятора возвращаются в исходное положение и подача питательной среды прекращается. Затем процесс повторяется.Интенсивность люминесценции записывается непрерывно с помощью самописца. Скорость подачи питательной среды насосом-дозатором выбирается так, чтобы проток (отношение объема среды, прокаченного насосом за определенный промежуток времени к объему культиватора) был больше максимальной скорости роста бактерий. Пример. Готовят 2 л среды, содержащей, г/л: NaCE28-30 .12H|jO 8,0-10 КН(Р041,0-1,1 (NH4)LHP040,50-0,55 МдЗОд 7H(ip0,08-0,12 Глицерин1,0-2 ,5 Пептон5,0-5,1 Эта среда заливается в термостатируемый при 20t 0, культиватор емкостью 150 мл. После инокуляции бактерий исходная концентрация клеток 0,65 10 кл/мл, а интенсивность биолюминесценции 2,5 отн.ед. Барботаж осуществляют из расчета, чтобы количество подаваемого в 1 мин воздуха было равно объему культиватора, т.е. 150 мл/мин,после достижения заданного уровня, равного 40 отн.ед., замыкается позиционный регулятор и включается насос-дозатор подачи питательной среды, обеспечивающий скорость протока 1,5 ч-. Максимальная удельная скорость роста Ph. phosphoreum на данной среде равна 0, ч . После установления стационарного режима удельная скорость роста бактерий 0,3-0,35 ч , а число клеток 0,| х х1(Гв г/мл. Использование предлагаемого способа культивирования позволяет стаби лизировать биолюминесценцию РК phos phoreum с точностью t0,6%. При этом не требуется сложная аппаратура. Вся установка собрана из широко распространенных приборов и узлов. Произво дительность предлагаемого способа ку льтивирования в 2,5 раза выше, чем в периодическом режиме. Формула изобретения Способ непрерывного культивирова ния светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum на питательной сре де, содержащей источник углерода и минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности биолюминесценции питательную среду добавляют, когда биолюминесценция превышает заданный уровень, причем питательная среда содержит хлористый натрий, фосфорно ислый натрий двузамещенный, фосорнокислый калий однозамещенный, осфорнокислый аммоний двузамещеный, сернокислый магний, пептон и гЛи ерин при следующем соотношении омпонентов, г/л: Хлористый натрий Фосфорнокислый натрий двузаме8-tOщенный Фосфорнокислый калий однозаме1,0-1,1 щенный Фосфорнокислый аммоний двуза0,50-0,55 мещенный Сернокислый Mai- 0,08-0,12 Глицерин 1.0-2,5 Пептон 5,0-5,1 До 1000 мл Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Фиш A.M. Исследование некоорых сторон метаболизма светящихся бактерий в непрерывной культуре. Азтореф.канд.диссертации, Красноярск, 1969. 2.Wardley-Smlth В. et all. The continous culture of luminous bacteria. 3. Appl. Bact., 1975, 39, p.337-3 3 (прототип).