Питательная среда для культивирования светящихся бактерий РнотовастеRIUм LеIоGNатнI - продуцента люцифреразы Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C12N9/04 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для выращивания светящихся бактерий - продуцентов фермента люциферазы.

Цель изобретения - удешевление среды, увеличение выхода биомассы и удельной активности люциферазы.

На фиг. 1 показано изменение оптической плотности культуры светящихся бактерий Photobacterium leiognathi штамм 213 при различной концентрации гидролизата,

где К - контрольная питательная среда с 5 г/л пептона; 1-5 - питательная среда с заменой пептона гидролизатом в разной концентрации; 1 - 0,25%; 2 - 0,5%; 3 - 1 %; 4 -2,5%; 5 -5%; на фиг. 2 - изменение удельной интенсивности люминесценции светящихся бактерий Photobacterium leiognathi штамм 213 при различной концентрации гидролизата, где К - контрольная питательная среда с 5 г/л пептона; 1-5 - питательные среды с заменой пептона гидролизатом в разной концентрации; 1 - 0,25%; 2 -0,5%;

о о со о ю со

3- 1%;4-2,5%,5-5%; на фиг. 3 - изменение оптической плотности и удельной интенсивности люминесценции культуры светящихся бактерий Photobacterium leiognathi штамм 208 на контрольной среде (1, 2) и среде с содержанием гидролизата 1%(1,2).

Изобретение осуществляют следующим образом.

Готовят питательную среду, содержащую, г: глицерин-2,8-3,2; Na2HP04 -12Н20 5,0-7,0; КН2Р04 0,9-1,1; (NN4)2 НР04 0,45- 0,55; MgS04 7Н20 0,09-0,11. В качестве источника азота и стимулирующих веществ используют 0,25-2,5%-ный гидролизат из отходов переработки биомассы светящихся бактерий после выделения люциферазы, Гидролизат добавляют в среду до 1 л.

Для приготовления гидролизата готовят 5%-ную (по сухому весу) суспензию из остатков клеток светящихся бактерий после извлечения из них люциферазы в 0,5 н. растворе соляной кислоты и выдерживают ее 2/3 ч на кипящей водяной бане. После охлаждения суспензии доводят значение рН до 7,8-8,0 30%-ным раствором гидроокиси натрия и добавляют панкреатин в количестве 5% от сухого веса биомассы. Суспензию термостатируют в течение 2 сут. при 45°С в присутствии хлороформа (1 %) при периодическом перемешивании. Непрогидролизо- ванный остаток биомассы отделяют центрифугированием, гидролизат нейтрализуют, отстаивают и используют в качестве компонента питательной среды.

Гидролизат, полученный таким образом, имеет следующий состав, г/л:

Азот общий4,2

Азот аминный1,1

Углеводы общие2,7

Нуклеиновые компоненты5,6

Аминокислоты

Лизин1,10

Гистидин0,41

Аргинин0,90

Аспаргиновая кислота1,60

Треонин0,78

Серии0,57

Глютаминовая кислота2,20

Пролин0,50

Глицин0,80

Алании.,1,03

Цистин0,12

Валин1,01

Метионин0,47

Изолейцин0,86

Лейцин1,20

Тирозин0,58

Фенилаланин0,71

ементы

0,69 0,04 0,08 0,05 0,30

Получают гидролизат с концентрацией отходов из биомассы светящихся бактерий 5% по сухому весу.

0 Для получения питательной среды с меньшими концентрациями гидролизата берут исходный 5%-ный гидролизати разводят в определенном соотношении со средой, содержащей все остальные

5 компоненты. Получают питательные среды, содержащие гидролизат из отходов переработки светящихся бактерий с концентрацией 0,25; 0,5; 1,0; 2,5: 5,0%.

П р и м е р 1. В стерильную колбу объе0 мом 500 мл заливают 142,5 мл стерильной питательной среды, содержащей, г/л: NaCI 30-0; №2НРСм 12Н20 6,0; КН2Р04 1,0; (NH4)2HP04 0,5; MgSCM -7H20 0,1; глицерин 3,0 и 7,5 мл, 5% гидролизата из светящихся

5 бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата по сухому весу 0,25%. Затем вводят 1 мл стерильного инокулята светящихся бактерий Photobacterium leiognathi 213, в процес0 се инкубации наблюдают рост и люминесценцию бактерий. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 1), концентрация биомассы, выращенной на среде с гидролизатом, измерен5 ная по оптической плотности, а также интенсивность люминесценции через 3 ч от начала культивирования ниже контрольной (среда с пептоном) на 6 и 4% соответственно.

0Пример 2. В стерильную колбу объемом 500 мл заливают 135 мл стерильной питательной среды, содержащей, г/л: NaCI 28,0; Na2HP04- 12H20; KH2P04 0,9; (МН4)2НРСмО,45; MgSCM -7Н20 0,09; глице5 рин2,8и 15 мл 5% гидролизата из светящихся бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата по сухому весугО,5%. Затем вводят 1 мл стерильного инокулята светящихся бакте0 рий Photobacterium leiognathi 213 и наблюдают рост и люминесценцию бактерий. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 2), концентрация биомассы, выращенной на среде с гидролизатом,

5 измеренная по оптической плотности, а также интенсивность люминесценции через 4 ч от начала культивирования выше контрольных на 25 и 12% соответственно.

Пример 3. В стерильную колбу объемом 500 мл заливают 120 мл стерильной питательной среды, содержащий, г/л: NaCI 32,0; Na2HPCM -12Н20 7,0; КН2РС-4 1,1; ()2HP04 0,55; МдЗСм -7Н20 0,1; глицерин 3,2 и 30 мл 5% гидролизата из светящихся бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата по сухому весу 1%. Затем вводят 1 мл инокулята светящихся бактерий Photobacterlum leiognathl 213 и наблюдают рост и люминесценцию. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 3), концентрация биомассы, выращенной на среде с гидролизатом, измеренная по оптической плотности, а также интенсивность люминесценции через 4 ч от начала культивирования выше контрольных на 120 и 48% соответственно.

Пример 4. В стерильную колбу объемом 500 мл загружают 75 мл стерильной питательной среды, содержащей, г/л: NaCI 30,0; Na2HP04 -12Н20 6,0; КН2Р04 1,0; (NH4)2HP04 0,5; MgSCM 7Н20 0,1; глицерин 3,0 и 75 мл 5% гидролизата из светящихся бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата светящихся бактерий по сухому весу 2,5%. Затем вводят 1 мл инокулята светящихся бактерий Photobacterium lefognathi 213 и наблюдают рост и люминесценцию. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 4), концентрация биомассы, выращенной на среде с гидролизо- том, измеренная по оптической плотности, а также интенсивность люминесценции через 5 ч от начала культивирования выше контрольных на 40 и 20% соответственно.

Пример 5. В стерильную колбу объемом 500 мл заливают 150 мл стерильного 5%-ного гидролизата, содержащего, г/л: Na2HP04-12H20 6,0; КН2Р04 1,0; (NKUfcHPO 0,5; MgS04 7Н20 0,1; NaCI 30,0 глицерин 3,0. Затем вводят 1 мл инокулята светящихся бактерий Photobacterium lelognathi штамм 213 и наблюдают рост и люминесценцию. Как видно из результатов, представленных на фиг. 1 и 2 (кривые 5), концентрация биомассы, выращенной на оптической плотности, а также интенсивность люминесценции в течение всего времени культивирования остаются существенно ниже контрольных значений.

Примерб. В стерильную колбу объемом 500 мл заливают 120 мл стерильной питательной среды, содержащей, г/л: NaCI 30,0; №2НРСм -12Н20 6,0; КН2Р04 1,0;

(NH4)2HP04 0,5; MgSCM 7Н20 0,1: глицерин 3,0 и 30 мл гидролизата из светящихся бактерий. Таким образом получают питательную среду с содержанием гидролизата

5 светящихся бактерий по сухому весу 1 %.

Затем вводят 1 мл инокулята светящихся бактерий Photobacterium leiognathi штамм 208 и наблюдают рост и люминесценцию. Как видно из результатов, пред0 ставленных на фиг. 3, концентрация биомассы, выращенной на среде с гидрозатвором, измеренная по оптической плотности (кривые 1), а также интенсивность люминесценции (кривая 2) через 4 ч от нача5 ла культивирования были выше контрольных на 95 и 70% соответственно.

Как видно из представленных данных, использование в качестве стимулятора роста бактерий гидролизата из отходов светя0 щихся бактерий, получаемых после выделения люциферазы, в концентрациях от 0,5 до 2,5% по сухому весу позволяет повышать выход фермента люциферазы за счет увеличения выхода биомассы и повы5 шения максимальной удельной интенсивности люминесценции в 3 раза по сравнению с известной.

Формула изобретения

0Питательная среда для культивирования светящихся бактерий Photobacterium lelognathi - продуцента люциферазы, содержащая глицерин в качестве источника углерода, источника азота и стимулирую5 щих веществ, хлористый натрий, двузаме- щенный фосфорнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, двузамещенный фосфорнокислый аммоний и сернокислый магний, отличающаяся

0 тем, что, с целью удешевления среды, увеличения выхода биомассы бактерий и удельной активности люциферазы, среда содержит в качестве источника азота и стимулирующих веществ 0,25-2,5%-ный кис5 лотно-ферментативный гидролизат из отходов переработки биомассы продуцента после выделения люциферазы при следующем соотношении компонентов, г/л: хлористый натрий 28,0-30,0; двузамещенный

0 фосфорнокислый натрий 5,0-7,0; однозамещенный фосфорнокислый калий 0,9-1,1; двузамещенный фосфорнокислый аммоний 0,45-0,55; сернокислый магний 0,09-0,11; глицерин 2,8-3,2; 0,25-2,5%-ный кислотно5 ферментативный гидролизат из отходов переработки биомассы продуцента после выделения люциферазы до 1 л.

J}

отн.ед.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для выращивания светящихся бактерий продуцентов фермента люциферазы. Цель изобретения - удешевление среды, увеличение выхода биомассы бактерий и удельной активности люциферазы. Активность увеличивается в 3 раза. Питательную среду для культивирования PHOTOBACTERIUM LEIOGPATHI - продуцента люциферазы готовят на основе 0,25 - 2,5 %-ного кислотно-ферментативного гидролизата из отходов переработки биомассы светящихся бактерий PHOTOBACTERIUM LEIOGNATHI после выделения фермента люциферазы. Для приготовления гидролизата остатки клеток светящихся бактерий после удаления из них люциферазы обрабатывают 0,5 н. раствором соляной кислоты, а затем проводят ферментативный гидролиз панкреатином. 3 ил.

J/Я D Г

0тн.е&.

7 f,V

J/JJ U отн. опт. eff.

200