Способ определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине Советский патент 1982 года по МПК G01N21/76 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к люминесцентному анализу органических веществ, и предназначено для определения нитро флуоресцеина в аминофлуоресцеине. Аминофлуоресцеин - это исходный продукт при получении изотиоцианата флуоресцеина (ФИТЦ), являющегося одним из основных красителей, используемых для метки белка. Качество аминофлуоресцеина характеризуют следу ющие показатели: хроматографическая однородность и содержание аминофлуо/ ресцеина (не менее Э7%), определяемое диазотированием 1Известен способ определения аминофлуоресцеина в изотиоцианате флуоресцеина, заключающийс-ч в том, что анали зируемый образец растворяют в ацетоне и измеряют люминесценцию раствора при 403 нм 2. Исходным продуктом при получении аминофлуоресцеина является нитрофлуоресцеин, примесь которого в готовом продукте (аминофлуоресцеине) нежелательна. Способы определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине в литературе не описаны. Цель изобретения - разработка способа определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине. Поставленная цель достигается способом определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине путем измерения интенсивности люминесценции анализируемой пробы в среде 0,0005 М раствора соляной кислоты при 486 и 3 нм и расчета процентного содержания нитрофлуоресцеина по формуле У ()ДC250100 (2-5 g где t)o средняя интенсивность люми. несценции анализируемой пробы при 43 нм; 9 5 - интенсивность люминесценции анализируемой пробы при kQ6 нм; CJj интенсивность люминесценции анализируемой пробы с добавкой нитрофлуоресцеина при kB6 нм; К - коэффициент пересчета, равный 2; ДС - добавка нитрофлуоресцеина,г g - навеска образца, г. Способ осуществляют следующим образом. Навеску испытуемого образца амино флуоресцеина растворяют в абсолютированном этиловом спирте (присутстви воды уменьшает чувствительность опре деления) . Одновременно готовят раствор нитрофлуоресцеина в спирте. Затем, отбирают аликвотные части раствора аминофлуоресцеина, вводят определенные количества раствора нитрофлуоресцеина (добавки), подкисляют и через 30 мин измеряют интенсивности люминесценции растворов при Л , и 3 нм при возбуждении светом и нм соответстве но. Количественное определение нитро флуоресцеина в аминофлуоресцеине выполняют методом добавок. При использовании в качес е раст ворителя спирта, диметилсульфоксида, ацетона, уксусной кислоты растворы нитро-и аминофлуоресцеина имеют одинаковую желто-зеленую и соизмеримую по интенсивности люминесценцию а у аминофлуоресцеина наблюдается еще и значительная люминесценция в синей области. Таким образом, определение люминесцирующей примеси нитрофлуоресцеина на фоне люминесценции аминофлуоресцеина практически невозможно. Необходимо либо разделение люминесценции этих соединений либо учет вклада каждого соединения в общую люминесценцию. Установлено, что при подкислении спиртовых растворов амино-и нитрофлуоресцеина в области концентраций i кислоты 1 1 наблюдается уаеличение интенсивности люминесценции нитрофлуоресцеина в 25 раз, при этом у аминофлуоресцеина интенсивная синяя полоса с увеличением концентрации кислоты в растворе уменьшается. Этот эффект положен в основу предлага емого способа определения нитрофлуоресцеина. В качестве рабочей концентрации выбрана кислоты, при которой наблюдается максимальное увеличение интенсивности люминесценции нитрофлуоресцеина, в то время как люминесценция аминофлуоресцеина изменяется незначительно, т.е. имеют дело практически с нелюминесцирующей формой аминофлуоресцеина. Поскольку полосы люминесценции нитро-и аминофлуоресцеина совпадают ( нм) , поэтому при их совместном присутствии интенсивность люминесценции в этой области определяет их суммарное содержание. Так как аминофлуоресцеин обладает еще и синей полосой,, то количественную характеристику его можно, проводить как по синей (43 нм), так и по зеленой (86 нм)полосе люминесценции. Введя коэффициент пересчета К, учитываихций соотноше-ние интенсивностей этих полос, можно, учесть вклад аминофлуоресцеина в суммарную люмийесценцию обоих соединений (нитро-и аминофлуоресцеина), измеренную при 86 нм. Коэффициент К подсчитываютпо трем образцам аминофлуоресцеина, практически не содержащих нитрофлуоресцеин. Так как интенсивность люминесценции аминофлуоресцеина при k86 нм значительно больше, чем при 3 нм, то измерение, интенсивностей люминесценции при этих длинах волн выполняется при различных напряжениях прибора. Коэффициeнt 42 (отношение полос люминесценции D486/ ) автоматически включае в себя и поправку на усиление прибора при переходе от напряжения 100 к 1000 В. В табл, 1 приведен подсчет К для образца, практически не содержащего нитрофлуоресцеин. Пример. 0,017г аминофлуоресцеина в 250 мл абсолютированного этиового спирта. 0,01 г нитрофлуоресцеина растворяют в 100 мл такого же спирта, 1 мл полученного раствора омещают в пробирку, прибавляют 9 мл пирта, перемешивают. Полученный растор содержит 10 мкг/мл нитрофлуоресеина (рабочий раствор). В три пробирки емкостью 10 мл омещают по 1 мл раствора аминофлуоресеина, во 2-ю и 3-ю - соответственГно ,иО,8 мл рабочего раствора нитролуоресцеина, во все пробирки добавяют по 0,5 мл 0,002 М HCi в спирте.

спиртом доводят до 5 мл и перемешивают. Через 30 мин измеряют интенсивности люминесценции всех растворов при нм (возбуждение Х 450 нм) и при Дд kЗ нм (возбуждение нм). Содержание нитрофлуоресцеина вычисляют по вышеприведенной формуле.

Результаты определений нитрофлуоресцеина в трех образцах аминофлуоресцеина приведены в табл. 2.

Таблица 1

122 122

100 100

110 ПО Время проведения анализа 4045 мин. Предел обнаружения 0,08мкг/м Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять примеси нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине, что позволяет улучшить качество получаемого из него красителя.

Формула изобретения

Способ определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине, отличающийся тем, что, измеряют

Таблица 2

8,3

0,017

7,7

.810 8,7 0,017 ,-6

4-10

3,6

0,017

3,5

-6

8-10 0,017

3,7

-6

4-10

0,017

3,3

-6 840 0,017 3,5

() g

55

где DQ- средняя интенсивность люминесценции анализируемой пробы при 434 нм; интенсивность люминесценции анализируемой пробы в среде 0,0005 М растбора соляной кислоты при 486 и 434 нм и рассчитывают процентное содержание нитрофлуоресцеина по формуле V (D.-DoK) ДС 250-100 Jj .Зл дС 7Э3 3228интенсивность люминесцен- 9 навеска образца, г; ции анализируемой пробы при К М2, ч : . B6 им;Источники информации, интенсивность люминесценциипринятые во внимание при экспертизе анализируемой пробы с добав- j 1. ТУ 6-09-1 У, кой нитрофлуоресцеина при 2. Авторское свидетельство СТССР А86 нм;по заявке № 272386 /0, добавка нитрофлуоресцеина, г;кл. G 01 N 21/6, 1979.