Способ количественного определения аминофлуоресцеина в изотиоцианате флуоресцеина Советский патент 1982 года по МПК G01N21/64 

( СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОФЛУОРЕСЦЕИНА В.ИЗОТИОЦИАНАТЕ

. I

Изобретение относится к аналитической химии, .а именно к способам количественного определения аминог флуоресцеина в изотиоцианате флуоресцеина (ФИТЦ), который является люминесцентным микробиологическим красителем для метки белков.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ количественного определения ииофлуоресцеина в изотиоцианате флуЬрёсцеина путем растворения анализируемой пробы в гидроокиси натрия с последующим спектрофотометрированием попученного при этом раствора 1.

Недостатком способа является низкая точность - определение дает суммарное содержание аминофлуоресцеина как образовавшегося из изотиоцианата флуоресцеина, .так и находящегося в виде примесей в изотиоцианате флуоресцеина. Раздельное же определение ФЛУОРЕСЦЕИНА

их по спектрам поглощения невозможно, так как они совпадают.

Цель изобретения - повышение точности определения.

Поставленная цель достигается тем, 4to в качестве растворителя используют ацетон и измеряют флюоресценцию полученного раствора.

Определение проводят на приборе КФЛ-2-1 со скрещёнными светофильтра10ми: СЗС-21 (3) (2) - первичный, вгьричный - ОС 12 (3)- ОС-13 (З). Либо на установке на основе ИСП-51 с фотоэлектрической приставкой, с использованием в качестве источниISка возбумсдения осветителя ОЙ-18 со светофильтром УФС-3.

Определение проводят методом добавок.

0,05 г флуоресцеинизотиоцианата растворяют в мерной колбе в 100 мл ацетона. Одновременно готовят раствор аминофлуоресцеина, для исго 0,025 .г его растворяют в 100 мл ацетона в мерной колбе. В три мерные колбы емкостью 50 м помещают 25 мл раствора ФИТЦ, затем во вторую и третью добавляют соответственно 0,5 и 1,0 мл раствора ам нофлуоресцеина и доводят объем раст вора аминофлуоресцеина и доводят объе раствора во всех трех колбах ацетоном до метки. Измеряют интенсивность люминесценции в трех растворах и холостом опыте при работе на ИСП-51 при kQ3 Содержание аминофлуоресцеина в процентах (Х) вычисляют по формуле V (ii-ixo/0 С-JOG nr-;)i . (26-1) 0 000123- 00 - ..о. -Т8Т 2бУ:о;б5 ° где с - количество добавленной кисло ты, икг, g - навеска анализируемого обра ца, г. mi° - W °-°-°Интенсивность люминесценции раст вора в первой колбе (Ц)-2б, во вто рой колбе (1|2)-81, в третьей колбе (1з), холостой пробы (1хол)1. При числе определений (п), равно , среднем результате (X),i5 (0,0045 г/мл ),надежности определения (р) ,95i коэффициент Стьюде та равен 3,18 (tp,). S(x-x)Qотклонение 5 Стандартное 2,15-10 Относительное стандартное отклонени с sjil5:l flr 0,048 t-x 4,15-10 Относительная погрешность среднего результата tf,n $ч100 3il8-0,t}8100 , -- --/,ь;б . Предел обнаружения, вцмисленный по 35-критерию на основании калиб-( ров очной кривой составляет или 410 %. Время проведения анализа 15 мин. Ошибка определения tO,6. Выбранный растворитель (ацетон) и условия возбуждения и люминесценции гарантируют определение аминофлуоресцеина, находящегося в растворе только в виде примеси, так как ФИТЦ легко гидролизуется с образованием аминофлуоресцеина, от выбора, растворителя зависит правильность определения, Из всех опробованных растворителей только в ацетоне практически не происходит гидролиза ФИТЦ, о чем судили по постоянству интенсивности свечения ФИТЦ во времени. Формула изобретения Способ количественного определения аминофлуоресцеина в изотиоцианате флуоресцеина путем растворения анализируемой пробы в растворителе, отли чающий ся тем, что, с целью повышения точности определения, в качестве растворителя используют ацетон и,изменяют флуоресценцию полученного раствора. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Изотиоцианатфлуоресцеин. ТУ-6-09-5823-69 (прототип).