Способ определения активности холинэстеразы в биологических жидкостях Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохи- ( мии и касается определения актив- ,ности ферментов.

Известен способ определения активности холинэстеразы в биологических жидкостях путем измерения скорости изменения потенциала окислительновосстановительного электрода, помещенного в испытуемую биологическую жидкость с добавлением субстратар.

Однако известный способ обладает недостаточно высокой чувствительностью (0,5-0,005 е/мл).

Цель изобретения - увеличение чyвct8итeльнocти способа,

Указанная цель достигается тем, что способ определения активности . холинэстеразы в биологических жидкостях осуществляют путем измерения скорости изменения потенциала окислительно-восстановительного электрода , помещенного в испытуемую биологическую жидкость с добавлением субстрата, электрод предварительно

уравновешивают в М растворе ферротферрицианида калия или в М водного раствора йода.

На фиг,1 приведены кривые зависимости потенциала от времени гидролиза ацетилтиохолин бромида при различных активностях холинэстеразы сыворотки крови лошади (электрод ЭО-1 предварительно уравновешен в

10 О, 1 М раствора ферро-феррицианида калия; активность фермейта на кривых 1-6 соответственно равна 10; 10,1; 0,01; 0,001 и 0,00012 е/мл, на кривой 7 представлен спонтанный

IS гидролиз); на фиг, 2 - кривые зависимости потенциала от времени гидролиза ацетилтиохолин бромида при различных активностях холинэстеразы сыворотки крови лошади (электрод

20 ЭО-1 предварительно уравновешен в 5-Ю М растворе 1-2.; активность фермента на кривых 1-6 соответственно равна 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001 и 0,0001 е/мл, на кривой 7 представлен спонтанный гидролиз). Пример 1. В термостатируему кювету объемом 2 мл наливают 1,О мл раствора фермента бутирилхолинэстера зы сыворотки крови лошади на 0,1 М фосфатном буфере рН 7, 8,0 с активностью от 20 до 210 е/мл. Элек трод 30-1 предварительно уравновещи1вают в 0,1 М растворе ферро-феррицианидов, затем промывают З- раза водой и пс ещают в исследуемую реак|Ционную смесь. Электродом сравнения служит хлорсеребряньЙ:1 электрод в насыщенном растворе хлористого калия (ЭвЛ-1М-3). Электроды подключают к рН-121 или . Потенциал системы всегда составляет 236 мВ. Затем добавляют 1 мл 2,-10 М ацетилтиахолин бромида и измеряют скорость падения потенциала в диапазоне 200-100 мВ (фиг.1). После окончания измерений электрод промывают несколько раз водой, помещают на несколько минут в раствор ферриферроцианидов, после чего он снова готов к работе. П р и М е р 2. В термостатированную кювету объемом 2 мл наливают 1,0 мл раствора фермента бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади на 0,1 М фосфатном буфере рН 7, 8,0 с активностью от 20 до 2-10 е/м и 0,01 мл свежеприготовленного водного раствора I2(5-10 М). В раствор помещают индикаторный электрод 30-1 и хлорсеребряный электрод сравнения. cтaнaвJlивaют потенциал 412 мВ. Затем в реакционную смесь вносят 1 мл ацетилтиохолинбромида и измеряют скорость падения потенциала от kOQ до 300 мВ (фиг.2). После опыта электрод промывают также, как указано в примере 1. Предлагаемый способ позволяет увеличить чувствительность до 1,210 е/мл и диапазон измерения активности холинэстеразы (10 10 4е/мл). Формула изобретения Способ определения активности холинэстеразы в биологических жид1 остях путем измерения скорости изменения потенциала окислительновосстановительного электрода, помещенного в испытуемую биологическую жидкость с добавлением субстрата, о т ли ч а ю щи и с я, тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, электрод предварительно уравновешивают в - растворе ферро-феррицианида калия или в 10 - 10 М водного раствора йода. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Kraner D.N., Gannon P.L. and Guilbault G.G. Electrochemical detemination o cholinrsterase and thiocholine esters. Analytical chemistry, 1962, З, N7, P. 8i 2Bks.