Способ получения тирозин- и серинсодержащих пептидов Советский патент 1982 года по МПК C07K5/103 C07K1/10 C07K14/695 

1

Изобретение относится к улучшенному способу получения тирозин- и сериисодержащих пептидов, которые могут найти применение как полупродукты при синтетическом получении адренокортикотронина и его аналогов.

Известен способ синтеза АКТГ методом ступенчатого наращивания цепи с N-конца с использованием трифенилфосфита и имидазола в качестве конденсирующего агента, при этом гидроксилы тирозина и серииа защищают бензильными группами (1.

Недостатком этого способа является необходимость защиты ОН группы тирозина и серима. Соответствующие о-бензилпроизводные тирозина и серина являются труднодоступными соединениями. Их применение связано с применением натрия в жидком аммиаке и другими осложнениями. В то же время при отщеплении бензильной группы от тирозина жидким фтористьгм водородом, что применяется при тотальном снятии защитных групп с АКТГ и его аналогов, происходит мигращ1я бензи-гьной группы в тертьее положение фенильиого остатка THjwJHHa 21.

Известен азидаый метод ступенчатого нара- щивания пептидной цепи с N-конца азидным сочетанием двух дипептидов или комбинация азидного метода с карбодиимидным 3 и 4.

Примеиеиие азидного метода дпя синтеза пептидов с аминокислотной последовательностью АКТГ дает возможность вводать тирозин и серии в пептидную цепь с незащищенными гидроксильными группами, одиако наблюдается большое число лобочных реакций, что снижает качество целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения серии- и тирозинсодержащих пептидов путем последовательного наращивания пептидной цепи с С-коица конденсацией защищенных по аминогруппе остатков тирозина и серина с защищетаым аминокислотным компоиентом в присутствии в качестве конденсирующего агента N, N-дициклогексилкарбодиимида в ацетонитриле при охлаждении, с использованием для зашиты не вступающих в реакцию аминокислотных остатков бутнлоксикарбонильных групп (ВОС) 16). Недостатком этого метода является то, что N,Nдицlfклoгeкcипкapбoдиимид сильный аллерген и работа с ним требует особых мер предосторожности, что усложняет использование этого метода в укрупненных масштабах. Кроме того, присоединение ВОС-серина и ВОС-тироэина проводят в растворе ацетонитрила или смеси ацетонитрилдиметилформамид Для отщепления защитных ВСХ -групп исполь зуют трифторуксусную кислоту или раствор избыточного количества хлористого водорода в уксусной кислоте при комнатной температуре в течение 5 мин. Цель изобретения - упрощение процесса, улутаиение условий труда, повышение качества и расширение ассортимента целевых продуктов, которые могут быть использованы в синтезе адренокортикотропного гормона. Поставленная цель достигается способом получения тирозин- н серинсодержащих пептидов общей формулы Z - Y - Туг - Ser - X где X - Met, NIeu; У - Sar; - Ala, Serz,Dser; Е - метил или этнл; Z - бензилоксикарбонил, путем последовательного наращивания пептид ной цепи с С-конца конденсацией защищенных по аминогруппе остатков THpo3ima и се рина с защищеннь1м аминокислотным компонентом в присутствии в качестве конденсиру ющего средства 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина, с последующим снятием защитных групп обработкой хлористьпи водородом при комнатной температуре.Процесс наращивания пептидной цепи проводят в растворе хлористого метилена при комнатной температуре, для защиты a fинokиcлoтных остатков тирозина н серина используют О -нитрофенилсульфенильную группу, снятие О -нитрофенилсульфенильной защЬты проводят раствором эквивалентного количества хл ристого водорода в зтаноле в течение 2-5 м Осуществление предлагаемого способа позв ляет использовать незащищеннь1е по гидрокси лу серин и тирозин при полном отсутствии побочных реакций по этим группам. Для очистки промежуточных продуктов не требуе ся ни перекристаллизация, ни хроматография Образующиеся побочные продукты удаляются экстракцией. Органические растворители упаривают на роторном испарителе при остаточном давлении 12-15 мм рт. ст. и температуре 3040° С. Температуру плавлення (разложения) определяют в открытых кагшллярах без коррекцни, углы вращения - на поляриметре фирмы Перкин-Элмер (модепь 141). Электрофоретический анализ проводят на бумаге Фильтрак-ФН 16 (ГДР) в 30%-ной уксусной кислоте (рН 1,9) при потенциальном градиенте 18 В/см в течение 1,5 ч. Электрофоретическая подвижность соединения (Е ) определена по отнощению к гистидину. Хроматографическая подвижность определена на пластинках Сш1уфол-254 (Чехословакия) в системах; н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1), бензол-этилацетат-метанол (6:2:1) и бензол-ацетон (2:1). Проявление злектрофореграмм проводят нингндрином, пятна на хроматограммах обнаруживают нингидрином, реактивами РейнделаХоппе, Паули и в УФ-свете при, 254 нм. Образцы для элементного анализа высушивают в течение 10 ч в вакуумном эксикаторе над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия. П р и- м е р 1. Метиловый эфир о-нитрофенилсульфенил-серил-метионина (I). К суспензии 24,1 г (55 ммоль) днциклогексиламмонневой соли о-нитрофенилсульфенилсерина в 350 мл хлористого метилена прибавляют 10,0 г (55 ммоль) гидрохлорида метилового эфира метионина и перемешивают при комнатной температуре 15 мнн. Прибавляют 13,6 г (55 моль) 1-этоксикарбонил -2-этoкcи-l,2-дип дpoxинoлинa и реакционную смесь оставляют на ночь. Отфильтровывают осадок гидрохяорида дициклогексиламина и растворитель упаривают. Остаток растворяют в 450мл этилацетата, промывают 5%-ным раствором МаНСОз (4 X 50 мл), 10%-ным раствором KHSO4 (4 X 50 мл) и водой (2 х 50 мл). Упаривают и остаток сушат азеотропной отгонкой с бензолом (50 мл). Кристаллизуют из петролейного эфира, фильтруют и получают 19,5 (94,6%) желтого-защищенного дипептида (I), Т.ПЛ. 91-97°С. Rf 0,42. Rf 0,47. а -50,6° (с 1, диметилформамид). Вычислено, %: С 44,65; Н 5,25 N 10,41. CisHjiOgNaSj Найдено, %: С 44, 73; Н 5,26; N 10,20. Пример 2. Гидрохлорид метилового эфира серил-метионина (fl)К раствору 6,05 г (15 ммоль) защищенного дипептида (I) в 200 мл абсолютного этанола прибавляют 10 мл 1,5 раствора хлористого водорода в абсолютном этаноле и выдерживают при комнатной температуре 2-5 мин. Растворитель упаривают и остаток встряхивают с 300 мл воды и 50 мл этилацетата. Этилацетатный слой отбрасывают и водный слой промывают этипацетатом (5 х 50 мл). Водный раствор перемешивают с активированным ytTieM при комнатной температуре 2 ч и фильтруют. Упаривают воду досуха и полученный свободный дипептид (II) без дальнейшей крис таллизащш используют на следующей стадии Rf 0,47, ,82. Пример 3. Метиловый эфир о-нитрофе нилсульфенилтирозил-серип-метиоиина (III). Получен аналогично защищенному дипептиду (I) (пример 1) из дициклогексиламмоииевой соли о-нитрофепилсульфенилтирозина и гидрохлорида дипептида (II). Продукт представляет собой желтое аморфное вещество. Выход 85%, Т.ПЛ. 78-88С. R| 0,43; R| 0,34. а + 34,4° (с 1, диметилформамид). Вычислено, %: С 50,87; Н 5,33; N 11,31. Cj4H3oN4O8S2 Найдено, %.С 52,27; Н 5,33; N 11,26. Пример 4. Гидрохлорид метилового эфира тирозил-серил-метионина (IV). Снятие защитной группы с защищенного трипептида (III) проводят аналогично снятию с защищенного днпептида (I) (пример 2). Гидрохлорид трипептида (IV) представляет собой аморфное гигроскопическое вещество R 0,55. 0,68. Пример 5. Метиловый эфир карбобе зоксн-)8-аланин-тирознл-серил-метионина (Yd) 0,89 г (2,2 ммоль) дициклогекснламмоииевой соли карбобензоксн-/ -аланина и 0,93 г (2,06 ммоль) гидрохлорида трипептида (IV) в 20 мл хлористого метилена перемещивают при комнатной температуре 15 мин. Прибавляют 0,54 г (2,2 ммоль) 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина и оставляют на ночь. Отфильтровывают осадок гидрохлорида диш1клогекснламина, растворитель упаривают и остаток растворяют в 100 мл н-бутанола. Промывают 5%-ным раствором МаНСОз (2 X 50 мл), 10%-ным раствором KHSO4 (2x50 мл) и водой (2x50 мл). Органический слой упаривают и остаток обрабатывают диэтиловым эфиром. Фильтруют и получают 1,14 г (90,0%) защищенного тетрапептида ( Vq ). Т. пл. 102-iWC. R 0,76. R 0,37. ,5 (с 1, диметилформамид). Вычислено, %: С 56,29; Н 6,19; N 9,05. С2,НззМ4095 Найдено, %: С 56,28; Н 6,13, N 9,57. Пример 6. эфир карбобензокси-и-серил-тирозил-серилметионина (УЯ). К раствору 4,5 г (10 ммоль) гидрохлорида трипептида (IV) в 100 мл хлористого метилена прибавляют 2,1 мл триэткпамина и 2,4 г (10 ммоль) карбобензокси-Ьсерииа. Пе ремещивают при комнатной температуре 15 мин, прибавляют 2,5 г (Ю ммоль) 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин и оставляют на ночь. Гелеобразную реакционную смесь упаривают я остаток обрабатывают 150 мл зтилацетата. Фильтруют и оса-. 476 док на фильтре промывают несколько раз концентрированными растворами НаНСОз. KHS04 и водой. Осадок растворяют в минимальном количестве этанола, разбавляют водои и насьпцают хлористым натрием. Фильтруют осадок, тщательно промывают на фильтре водой. Получают 5,1 г (80,5%) защищенного тетрапептяда ( V6 ) т.пл. 163167С, R 0,96, Rf 0,32, М - 17,0° (с 1, диметилформамид). Вычислено, %: С 54,87; N 8,82; Н 6,03. C29H3 N,,O,oS Найдено, %: С. 55,33; N 8,27; Н 6,13. Пример 7. Метиловый эфир карбобензокси-О-серил-тирозил-серилметионина (Ve)Получен аналогично тетрапептнду (V S ) (пример 6) из карбобензокси-О-серина и . трипептида ( у ). Выход 63,4%, т.пл. 128132°С, R 0,96, Rf 0,32, el (с I, днметилформамид). Вычислено, %: С 54,87; Н 6,03; N 8,82. C29H38N40,o5 Найдено, %: С 55,17; Н 6,01; N 8,97. Пример 8. Гкдрохлорид этилового эфира норлейщша (VI). К 50 мл абсолютного этанола при -10°С и интенсивном перемещивании прибавляют по каплям 18,3 мл (250 ммоль) хлористого тионнла. Поднимают температуры до комнатной и прибавляют 30 г (227 ммоль) норлс НИНЕ. Полученную суспензию перемещивают при комнатной температуре 16 ч и прибавляют 350 мл смеси петролейного и днэтилового эфиров (1:1). Выпавщий осадок фильтруют и промывают на фильтре этой же смесью (3x50 мл). Выход 44,4 г (количественный), т.пл. 129-130°С, Rf 0,47, E.,94. al + П,9С (с 1, этанол). Вычислено, %: С 49,90; Н 9,27; N 7,11. CgHisbjCI Найдено, %: С 49,46; Н 9,34; N 7,33. Пример 9. Этиловый эфир о-нитрофеиилсульфенило-серил-норлейщша (VH). Получен аиалогичж) эащищенному днпептиДУ (О (пример 1) из дициклогексиламмониевой соли о-иитрофешшсульфенилсерина и гидрохлорида этилового эфира., норлейщша. Выход 90,4%, Т.Ш1. 124-125, R| - 0,59; R| - 0,52. lo -77,0° (с 1, этанол). Выедслено, %: С 51.12; Н 6,31; N . С|7И25МэОб8 НанДйю, %: С 52,00; Н 6,21; N 10,77; Пример 10. Гндрохлорид этилового эфира сернл-норцейцина (Vlll)Защитную группу с НФС-дипептида (VU) снимают по описанному методу (пример 2). Выход количественный, т.пл 114-115°С.

Rf - 0.69. ,0.81. (с 1. этнол) .

Вычисяеио, %: С 46.72; Н 8,20; N9,91.

C,,M,3Nj04CI ,

Найдено, %: С 46,77; Н 8,17; N 9,84. Пример 11. Этиловый эфир о-иитро({кннлсульфенил-тнроэип-серип-норлейщша (IX).

Получен аналогично защищенноксу днпептнду 1 из дициклогексиламмониевой соли онитрофенилсульфениптирозина и гидрохлорнда трйпептида (VIII) Слвыходом 89%. Т.пл. 73° С с разложением Rf 0,47, Rf 0,40, Ia |jr:+ 65.8 (с 1, этанол).

Вьлшслено, %: С 55.63; Н 6,09, N 9.96.

C,eH34SN408

Найдено, %: С 56,12; Н 6,03; N 10,12.

Пример 12. Гидрохлорид этилового эфира тирозил-серил-норлейцина (X).

Защитную группу с трйпептида (IV) снимают по описанному методу (пример 2)..Выход 91%, Т.пл. 145С с разложением. Rf 0,69. Е 0,77.

Пример 13. Этиловый эфир карбо-. бензокск-саркозил-тирозил-серилнорлейцина (XI).

Получают аналогично защищенному тетрапептиду (VS) (пример 6). Выход 82,5%, Т.пл. 123°С с разложением, Rf 0,48. а 0.5 (с 1. диметилформамид). .

Вычислено. %: С 60,57; Н 6,89; N 9,11.

C3jH42N4O9

Найдено, %: С 60,72; Н 7,19; N 9,31.

Формула изобретения

Способ получения тирозин- и серинсодержащих пептидов общей формулы

Z-Y-Tyr- Ser-X-OE, где X - Met, NIeu;

Y - Sar; /3 - Ala;Ser, DSer,

E метил или этил;

Z бензилоксикарбонил.

путем последовательного наращивания пептидной цепи с C-KOHua конденсацией защищеиных по аминогруппе остатков тирозина р серина с защищенным аминокислотным ком5 понентом в присутствии конденсирующего средства, с последующим снятием защитных трупп обработкой хлористым водородом, при комнатной температуре, отличающийся тем, что, с целью упрощения

процесса, улучщения условий труда, повышения качества и расширения ассортимента целевых продуктов, в качестве конденсирующего средства используют 1-этоксикарбошш-2-этокси-1,2-дигидрохинолин. провесе иаращивания пептидной цепи проводят в растворе хлористого метилена при комнатной температуре, для защиты аминокислотных остатков тирозина и серина используют о-нитрофенилсульфенильную группу, снятие

0 1О-нитрофенилсульфенильной защиты проводят раствором эквивалентного количества хлористого водорода в этаноле в течение

2-5 мин.

t

5Источники информации,

принятые во внимание при экспертизе

1.Гудков А. Г. и др. Синтез амида октадекапептида (1-18) /}-кортикотрошша с использованием трифенилфосфита и имидазола.Синтез декапептида (1-10) /3-кортикотропина. ДеИ 7534-73. РЖ Биофизика, 1974. № 4.

2.Bruce Erickson W., Merrifield R.B. Acid stability of several Benzylic Protecting groups used in solid-phase Peptide synthesis rearrangement of o-Benzyltyrosine - J. Amer. Chem. Soc. 1973. 95. N« 1. c. 3750.

3.Патент ФРГ № 2114300. кл. С 07 С 103/52, опублик. 1973.

4.Шредер Э., Любке К. Пептиды. Ч. 1. М., Мир, 1967, с. 116.

5.Патент Швейцарии № 497384.

кл. С 07 С 103/52, опублик. 1970 (прототип).