Способ получения полипептидов или их солей Советский патент 1982 года по МПК C07K7/06 A61K38/04 C07K7/23 

(5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ СОЛЕЙ

1

Изобретение относится к способу получения новых полипептидов - соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине.

В пептидной химии для конденсации пептидных фрагментов и аминокисп

Loiu-His-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-P, где если А - D-Tyr, D-Tyr(Me); D.-Ser, D-Ser(); D-Phe; D-Ala; D-Trp, TO В - Leu, Meheu; E - Azgly; F - W2, или если A - Arg 1y, Arala, TO В - Leu; E - простая связь; F - .-, или их солей, заключающийся в том, что конденсируют пептидные фрагменты

лот широко используют азидный и карбодиимидный методы lf.

Цель изобретения - получение новых полипептидов, обладающих интересными биологическими свойствами.

Поставленная цель достигается способом получения полипептидов формулы20 25 LGlu-His-OH б1и - His -trp - Ser-OH , или их азиды с пептидами Н-Тгр-Зег-Туг-А-В-Агд-Рго-Е-Е, или H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F соответственно, значения A,B,F и Е указаны выше, с последующим выделением целевого продукта в виде основания или соли. Контроль чистоты продукта осуществляют с помощью хроматографии в тон39ком слое С тех) силикагеля (марки кизельгель) . Для проявления хроматограмм испольЗуют системы растворителей при следующих объемных соотношениях: бутан-1-ол : уксусная кислота :вода 4:1:5 (М, А); бутан-1-ол :уксусная кислота : вода : пиридин 15:3:12:10 (Rf, В); бутан-2-ол:3 вес/обД водная гидроокись аммония 3:1 (Rf,C); ацетонитрил:вода 3:1 (Rf, D); ацетон хлороформ 1:1 (Rf, Е); хлороформ:эта нол 1:4 (Rf, F) ; циклогексангэтилаце тат 1:1 (Rf, G); циклогексан:этилацетат:метанол 1:1:1 (Rf,H); хлороформ:метанол:вода 11:8:2 (Rf,K); хлороформ:метанол 19:1 (Rf, Р) и хлороформ:метанол 9:1 (Rf,Q). Во всех случаях пластинки просматривают в ультрафиолетовом свете и обрабатывают такими реагентами как флуореск 1МИН, нингидрин и хлор-крахмал-иод. Для получения аминокислоткого состава получают кислотные гидролизаты путем нагревания пептидов или защищенных пептидов с 6 н. соляной кислотой, содержащей 1 вес/об. фенола В откачанной и запаянной ампуле в те чение 1б ч при 100 С. Аминокислотный состав каждого гидролийата определяют с помощью аминокислотного ана лизатора . Термин осуществля лось обычным способом, использованный в описании примеров, означает, что после проведения реакции весь твердый остаток отфильтровывают, фил трат упаривают досуха при температуре ниже , остаток в этилацетате промывают 20%-ным раствором лимонной кислотой, водой, насыщенным раствором бикарбоната натрия и водой сушат над безводным сульфатом нат рия, затем в вакууме упаривают этилацетат, в результате чего получают к нечный ПООПУКТПри описании процессов использованы следующие сокращения: ОСр - 2,4,5-трихлорфениловый слож ный эфир; Вг1 - бензил; Z - бензилоксикарбонил; БОС трет.-бутоксикарбонил; DMF - диметилформамид. Примеры 1 т8. Синтез L-пироглутамил-1-гистидил-1 триптофил-1-серил-L -тирозил-Л-1-лейцил-1-арги нил-L-пролил-E--F. Общий способ m (табл.1, примеры 1-3). К .охлажденной (ОС) суспензии L-пироглутамил-L-гистидингидразида(0,2 ммоль) в 0,9 мл диметилформамида и 0,7 мл диметилсульфоксида добавляют при перемешивании 5,7 н.раствор хлористого водорода в диоксане (0,8 ммоль). Через 5 мин интенсивного перемешивания получают прО-;рачный раствор. Раствор охлаждают до -20 С, добавляют 0,22 ммоль, трет,бутилнитрита и продолжают перемешивать 25 мин. Затем температуру понижают до -30 С, и раствор нейтрализуют добавлением 0,8 ммоль триэтиламина. После введения предварительно охлажденной смеси (-20С) L-триптофил-1-серил-1-тирозил-А-1-лейцил-L-арГИНИЛ-L-пролил-Е-F-ДИгидрохлорида (0,1 ммоль), полученного гидрогенолизом N-бензилоКСикарбонилпроизводного в 80 об.-ном водном растворе метанола, содержащем 2 эквивалента хлористого водорода, над 5 вес,% палладием на угле в течение 16 триэтиламина (0,1 ммоль) в 1 мл диметилформамида, реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч при . Диметилформамид отгоняют в вакууме, а остаток хроматографируют на Сефадексе 1Н-20, используя в качестве элюента диметилформамид. Полученный хлоргидрат пептида чистят с помощью разделительной хроматографии на Сефадексе &-25, используя в качестве растворителя систему н-бутанол:уксусная кислота : вода:пиридин 5:1:5:1Синтез 1-пироглутамил-1-гистидил-1-триптрфил-1-серил-1-тирозил-А-В-L-аргинил-1-пролил-азаглицин-амидаОбщийспособ VI (табл. 17 примеры 4-8). 1-пироглутамил-1-гистидил-1-триптофил-1-серин-гидразин (0,2 ммоль) растворяют в 4 мл диметилформамида и превращают в азид в соответствии со способом п. Его конденсируют по способуmс хлоргйдратом L-тиролизил-А-В-Ь-аргинил-1-пролилазаглицин-амида (о , 15 ммоль), полученному каталитическим восстановлением L-бензилокси карбонил-0-бензил-1-тирозил-А-1-лейцил-(N -нитро)-1-аргинил-1-пролил-азаглицин-амида в 80 водном метаноле в течение 20 часов над 5 вес.% палладием на угле, конеч ый продукт в виде хлоргидрата чистят как описывалось выше. Характеристики соединений, полуценных по предлагаемому способу cot- 5 ласно примерам 1-8, приведены в табл.1. П р и м е р ы 9 и 10. Соединения получают, используя один из основных способов m или 6. . Характеристики полученных соединений представлены в табл.2. На фиг. 1 и 2 представлены схемы получения исходных материалов, способ т; на фиг, - то же, способ п В кружки взяты номера, относящиеся к конкретной стадии. I.Раствор 19,9+ г (80 ммоль); -бензилоксикарбонил-1-пролина и 8,8 мл (80 ммоль)М-метилморфолина в 200 мл сухого тетрагидрофурана охлаждают до -20 С. По каплям добавляют 7,15 мл (76 ммсгль)этилхлорформиата и после двухминутного перемешивания добавляют 20 мл (ЗОО ммоль) предварительно охлажденного до 70%-ного водного раствора этиламина и продолжают перемешивание в течение 18 ч при С. Затем реакционную смесь обрабатывают обычным способом остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат;петролейный эфир (т.кип.60-8ос).Выход 1,97г( 53,7U т.пл. 107-1084; Cc(3|55i 3,88(c, 1 в метаноле) Rfu 0,б9; Rf р 0,53; RfFO,67; ,б2; R.fpO,57; Rj М II.Каталитическое восстановление продукта осуществляют над 5 весД палладием на угле в водном этаноле, содержащем один эквивалент хлористог водорода, в течение 5 ч при комнатной температуре. 111. Раствор 13,5 г (2,3 ммоль) М-трет.-бутоксикарбонил-М нитро-1аргинина, 7,15 г (7 ммоль) хлоргидрата L-пропил-этиламида, 11,5 г (86 ммоль) 1-гидроксибензотриазола и 6758 мл (Д7 ммоль) триэтиламина в диметилформамиде охлаждают до О С, и добавляют к нему 9,13 г С, ммол дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение- но чи при , выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток разделяют на фазы этилацетата и водную в противотоке (k переноса). Водные фазы объединяют упаривают досуха и остаток разделяют йа фазы н-бутанола и 5 об.-ной водной уксусной кислоты в противотоке (12 niepeHOcoB). Неочищенный пептид, полученный при выпаривании объединенных фаз н-6 166 танола, чистят с помощью колоночной хроматографии на силикагеле,используя в качестве элюента 5 об.-ный метанол в хлороформе и 10 об.%-ный метанол в хлороформе. Фракции, содержащие продукт, объединяют и упаривают досуха. Остаток растворяют в воде, и раствор пропускают через колонку с анионообменной смолой (AG 1-Х2) для удаления ГЬтреТо-бутоксикарбонил-М нитро-аргииина, Колонку промывают водой, и объединенные водные фракции и промывочные воды высушивают при температуре ниже , получают азепептидное производное, выход 16,67 г (89); т.пл. 109-111°С (с разложением) ;p,,0 (с, 1 в метаноле); Rf, А 0,62; Л, В 0, R.,C 0,59; Rjf,D 0,70; Rr, Е 0,20; Rr, F 0,60; R И 0,61; R К 0,85; Rj Q 0,13. IV.Раствор N-трет.-бутоксикарбонильного производного в этилацетате обрабатывают раствором Зн„ НС1 в этилацетате С эквивалента) в течение 1 ч при комнатной температуре. V.(RsH). Раствор 2,90 г(22 ммоль) трет.-бутоксикарбонилгидразида и 11,71 г (20 ммоль) N-бензилоксикарбонил-0-бензил-1-тирозин-2,, 5-трихлорфенилового сложного эфира в 0 мл диметилформамида выдерживают при комнатной температуре в течение ночи. После обработки этого продукта в соответствии с обычной методикой и с последующей перекристаллизацией полученного остатка из смеси эфир-петролейный эфир (т.кип. 60-80°С)получают защищенный гидразин в виде белого порошка, выход 3,6 г (67); т.пл.12б127 C;i;d3|f-13,2C (с, 1 в метанол ; R, О 0,82; R, Е 0,65; R$ F 0,63; Ri, Н 0,70. VI Раствор () 5,19 г (10 ммоль) 1-(М-бензилоксикарбонил-0-бензил-1тирозил)-2-трет.-бутилоксикарбонилгидразида в 50 мл этилацетата обрабатывают 5 н.хлористым водородом в 8 мл (0 ммоль)этилацетата в течение 1 ч при комнатной температуре. Этилацетат упаривают в вакууме, полученный хлоргидрат промывают эфиром и высушивают. V.I I . (). К 75 мл раствора указанного выше хлоргидрата в тетрагидрофуране добавляют 1,115 г(8 ммоль) триэтиламина, затем 1,3б г (8 ммоль), метилового сложного эфира N-карбонил-L-лейцина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 16 ч, затем ее обрабатывают обычным способом, и полученный остаток перекрйсталлизовывагот из смеси этилацетат :петролейный эфир т.кип. 6080С) , получают г азатрипептидного производного, выход 11,1%, т.пл. 15б-157С;Го Л -10,3(с, 1 в метаноле); R О 0,81; Rr., Е 0,45; R, Р 0,26; R., Q 0,47. . 5 мл ( 100 ммоль) гидрата гидразина добавляют к 2,95 г(5 ммол раствора метилового сложного эфира N-бензилоксикарбонил-О-бензил-Ц-тиро зилазоглицил-Ь-лейцина в 50 мл метанола. Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре, затем гидразид осаждают водой и перекристаллизовывают из смеси метанол:эфир, выход 2,74 г (92,8%); т.пл. 1б9-170С; (с, 1 в диметилформамиде D тч л П 7А D ; л 7С Ссх Г П 77. R|, А 0,76; Rp а 0,75; R;,C 0,73; Rr D 0,63; Rr F 0,60; Rr, H 0,55. IX. X. (R H). 1,18 г (20 ммоль М-бензилоксикарбонил-0-бензил-1-тиро зилазаглицил-1-лейнингидразида раст воряют в 10 мл диметилформамида и после охлаждения раствора до добавляют 1,46 мл (8 ммоль-) 5,49 М раствора хлористого водорода в диок сане, затем к реакционной массе добавляют 0,25 мл (2,2 ммоль) трет.-бутилнитрита. Через 5 мин раствор охлаждают до и добавляю к нему предварительно охлажденную смесь 0,83бг(2,2 ммоль)) хлоргидрат М -нитро-1-аргинил-1-пролин-этилами да и 1,43 мл (10,2 ммоль) триэтиламина в 10 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают при - в течение 1 ч и при в тече ние 48 ч. Реакционную смесь обрабатывают обычным способом, пентапептид мое производное чистят с помощью хро матографии на колонке с силикагелем используя в качестве элюирующего растворителя хлороформ и 3 об.-ный метанол в хлороформе, получают 0,695 г (38,5); R,. А 0,71; R,, 8о,7 R С 0,84. XI (). Каталитическое восстановление продукта проводят 5 вес.% палладием на угле в 80 об.-ном водном растворе уксусной кислоты, содержащем два эквивалента хлористого водорода. ХМ При интенсивном перемешивани к охлажденному qo -20С раствору 33,84 г (100 ммоль) N-бензилокси168карбвнил-и-триптофена и 11,0 мл (100 ммоль) N-метилморфолина в 200 мл тетрагидрофурана, добавляют 9,0 мл (95 ммоль) этилхлорформиата. Спустя 2 мин в реакционную массу вводят предварительно охлажденный (-20°С) раствор 17,10 г (11 О ммоль) хлоргидрата метилового сложного эфира 1-сер.1на и 12,1 мл (110 ммоль)N-метилморфолина в 150 мл диметилформамида и продолжают перемешивать при -20°С в те- чение 30 мин и затем при комнатной температуре 3 ч. Обработав полученный продукт обычным способом, получают масло. После двух кристаллизации из смеси эт1 лацетата и петролейного эфира (т.кип. 60-80 С) получают дипептидное производное, выход 30,53 г (69,5); т.пл. 140,5-141 C; ,13°(c 1,4 в диметилформамиде) XIII. К 1 л раствора в метаноле VIII L 1 п i-ч -.-г-, -, i-, .i--ч. шп 30,53 г (69,5 ммоль} полученного выше сложного эфира добавляют 15 мл 62 вес/об. расГвора гидрата гидразина. Спустя 16 ч выделяют гидразид, промывают его метанолом, эфиром и перекристаллизовывают из горячего этанола; получают 23,18 г (75,8), т.пл. 178-179C;CofJ 25, 27(с, 1 в диметилформамиде) ;Rri, D 0,65; Е 0,20; RJ F 0743; Rr, Н 0,50 Р ц и,и; t г u,4j); rvt., XIV, XV. 0,77 МЛ (4,64 ММОЛЬ 6,02 н.хлористого водорода в диоксане добавляют при перемешивании к охлажденному () раствору 0,502 г (Г,36 ммоль)N-бензилоксикарбонил-1-триптофилг1 серин-гидразида в 5.мл диметилформамида, затем в реакционную смесь вводят 0,14 мл (1,22 ммоль) трет.-бутилнитрита.Спустя 30 мин раствор охлаждают до -30 С и нейтрализуют, добавив 0,65 мл триэтиламина. В реакционную массу вводят предварительно охлажденную (-20 С смесь 0,547 г (0,77 ммоль) дихлоргидрата 1-тирозилазаглицил-и-лейцил -L-jЗpгинил-L-пpoлинэтилaмидa. и 0,108 мл (,(. ,11 ммоль)триэтиламина в 5 мл диметилформамида, реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при и в течение 48 ч при 4°С. Затем фильтруют, фильтрат упаривают досуха в вакууме. Полученный сырой пептид .чистят на хроматографической колонке с силикагелем, используя в качестве элюента хлороформ, 10 об.-ный метанол в хлороформе и смесь хлороформ:.метанол:вода 11:8:2,

9

выход 0,l42k г (52,9),84 (с, 1 ,5 в метаноле); Rr,, А 0,61; Rr, С 0,36; R|, D 0,б7Т Rr, К .0,90. XVIII. (). Процесс осуществляют в условиях Описанных в стадии V,. выход 66%; т,пл. 102-10it C,i:olJ 15,5 (с, 1 в метаноле); R, О 0,76 RJ, Е 0,68; R±, F 0,76; R, Н 0,7.

XIX. (R-Me). Аналогична стадии VI .

XX.(RsMe). Аналогидна стадии VII, выход 93, т.пл. И5-1 6С; ;«. ,7 (с. 1,2, в метаноле); Rp, А 0,88; R, В 0,88; R{, С 0,83; , D 0,80; R, t 0,59; Rf, Н 0,75.

XXI.к растиору 2,k г ( ммоль) метилового сложного эфира N-бензилоксикарбонил-0-бензил-1-тирозил-азалинил-1-лейцина в 36 мл метанола

при комнатной температуре при перемешивании добавляют 12 мл (12 ммоль) 1 Н.гидроокиси натрия, перемешивание продолжают еще в течение 3 ч. Метанол отгоняют в вакууме, и kO мл водного остатка подкисляют лимонной кислотой (рН 3), продукт экстрагируют этилацетатом. После промывки 5тилацетатного экстракта водой и сушки над сульфатом натрия растворитель отгоняют, остаток растворяют в 200 мл смеси диметилформамид:вода 3:2 и вводят в колонку со 100 мл смолы АС 1 Х-2. Колонку промывают 50 мл указанного выше растворителя, и трипептид элюируют 0,2 М уксусной кислотой в смеси диметилформамид: вода 3:2. Фракции, содержащие трипептид, объединяют упаривают в вакууме, остаток растирают с ЭФКРОМ) выход 1,22 г (51,7); т.пл. 195С (с разложением, ,4 (с, 1 в диметилформамиде).

XXII.(). Аналогична стадии 28, выход )25,9(c., 1 в ме-. таноле); Rr. А,0,72; Rr, В 0,76;

Rr, С 0,85.

XXIll(). Аналогична стадии XI.

XXIV. () .Аналогична стадии XV, с той разницей, что конечный продукт чистят фильтрацией на геле Сефадекс LH-20 в диметилформамиде, после хроматографической очистки на

силикагеле; выход 63 /с; jell-33 2,76 (с 0,8 в метаноле); RJ, А 0,58; R, С 0.42; R, О 0,65; Rf, К 0,95.

XXV. К 2k;3 г иОО ммоль) перемешиваемой и охлажденной (О С )сус1610

пензии М-бензилоксикарбонил-1-пролина добавляют 11,2г (100 ммоль) хлоргидрата семикарбазйда и ,5 мл (100 ммоль) триэтиламина в 200 мл диметилформамида, 20,6 г (100 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и перемешивание продолжают в течение 16 ч при k С. Дициклогексилмочевину отфильтровывают и фильтрат концентрируют. К остатку добавляют 200 мл воды и продукт из раствора жстрагируют этилацетатом СЗ х 50 ил). Через 1 ч из водного раствора продукт выпадает в осадок. Перекристаллизацией из

водного метанола получают амид дипептида; выход 1б,5 г СЗЗ.Э); т.пл.189190°C;rotJ ii3,6°(c, 1,4 в диметилформамиде); Rjg, D 0,5V, R, F 0,52; Rr. H 0,38; R, К 0,78.

XXVI. Каталитическое восстановление над 5 вес.- палладием на угле в 80 об.-ном водном диметилформамиде в течение 6 ч при комнатной температуре в присутствии двух эквивалентов хлористого водорода.

XXVII. К. раствору 8,24 г (31 ммоль) М-бензилоксикарбонил-1-лейцина и ,55 мл (32,5 ммоль) триэтиламина в 100 мл тетрагидрофурана при темрературе от -10 до -15 С добавляют 2,83 мл (29,5 ммоль этилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивают при этой температуре 3 мин и выливают в интенсивно перемешиваемый раствор 5,79 г (31 ммоль) Н нитро-1-аргинина в 15,5 мл (31 ммоль) 2 н.гидроокиси натрия и 50 мл диметилформамида при -10°С„ Полученную смесь перемешивают при -10 С в течение 30 мин, а затем при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток делят на части и помещают в смесь 50 мл этилацетата и 50 мл воды. Водную фазу отделяют, экстрагируют двумя порциями этилацет тата. Объединенные органические фазы промывают в 25 мл воды. Водные слои отделяют, объединяют и подкисляют насыщенным раствором лимонной кислоты, продукт экстрагируют этилацетатом (3x100 мл). Экстракты из этилацетата объединяют, промывают водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают досуха. После перекристаллизации остатка из смеси этилацетат-петролейный эфир (т„кип. 60-80°С) получают дипептид, выход 8,98 г( ); т.пл, 150-1б5°С (с разложением). 1.1 XXVII. К охлажденному до УС раствору 9,2. г (20 ммоль) N-бензилоксикарбонил-1-лейцил-{N -нитро -L-аргинина, ,2 г (20 ммоль) хлоргидрата L-пролилазаглицинамида, 5, г (0 ммоль) 1-гидроксибензо.триазола и 3 мл (20 ммоль) триэтиламина в диметилформамиде добавляют 8,2 г (0 ммоль)дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемеши вают в течение ночи при комнатной температуре. Дициклогексилмочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха. После перекристаллизации ос татка из смеси метанол:простой эфир получают тетрапептидное производное выход 12,2 г (38,3); т.пл. 88-90С о(Лд -30, 2 (с. 1,0 в диметилформамидe ;R.f, D 0,57; Rjf, F 0,АО; Ri:,H 0,26; R|, К 0,63. XXIX.Гидрирование над 5 вес.% палладием на угле в водном этаноле в течение 16 ч в присутствии двух эквивалентов хлористого водорода. XXX.6, г (11,0 ммоль) N-бензилоксикарбонил-0-бензил-1-тирозин-2,k,5-трихлорфенилового сложного эфира и 1,39б г (10 ммоль) хлоргидрата D-аланинмгтилового сложного эфира растворяют в 50 мл диметилфор мамида и 1, мл (10,0 ммоль)триэтил амина, и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь обрабатываю обычным способом, остаток перекристаллизовывают из горячего этилацета та, получают защищенный сложный метиловый эфир дипептида, выход 248 3,782 г (77.2%); т.пл. 1бЗ° CjfriJr -12,(с, 1,1 в диметилформамиде). XXXI.Раствор 3,35 г (7,0 ммоль) М-бензилоксикарбонил-0-бензил-1-тирозил-О-аланина метилового сложного эфира в мл теплого метанола обрабатывают 10 мл (120 ммоль) 62 вес/об. гидразин гидрата, полученную смесь оставляют на ночь при . Выпавший в.осадок гидразид отфильтровывают, промывают метаноло и эфиром и дважды перекристаллизовы вают из кипящего метанола. Выход „л 3,068 г (89,22;); т.пл. 217 C; olj|3 -20,4 (с, i;i в диметилформамиде) Ф, А 0,73; Rr, В 0.75; R. С 0,67; R Ri, D 0,70; R, E 0,50; R,F 0, R|, H 0,67; R., К 0,85; R, Q 0,25. XXXII и XXXIII. При перемешивани к охлажденному () раствору 612 1 ,1 8- г (2, ммоль) N-бендилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозил-О-аланингидразида добавляют 1,6 мл С 9,6 ммоль) 6,02 М раствора хлористого водорода в диоксане, затем 0,29 мл (2,52 лonti) трет.-бутилнитрита. Спустя 15 мин добавляют предварительно охлажденный (-20С) раствор 1,03 г (2,0 ммоль) 1-лейцил-1-аргинил-1-пролилазаглицин-амид-дигидрохлорида и 1,62 мл (11,6 ммоль)триэтиламина в 15 мл диметилформамида. Полученную смесь перемешивают в течение 2 ч При комнатной температуре, Хлоргидрат триэтиламина отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток помещают в колонку с силикагалем, продукт элюируют 5 об.%-ным метанолом в хлороформе, 10 об.-ным метанолом, в хлороформе и смесью хлороформ:метанол: вода 11:8:2. Фракции, содержавшие продукт, объединяют, и пептид чистят повторно колоночной хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюирующего растворителя смесь ацетонитрил:вода 3:1. Выход 890 мг (46,4%);Cot3|f-45, (с, 1,1 в метаноле); RP, А 0, R, В 0,69; K, С 0,Ai: XXXIV.Аналогична стадии XI. XXXV.Аналогична стадии XV, выход ,t(c, 1,3 в метаноле); Rf, А 0,80; R., С 0,7; Rr, D 0,65; Rf, К 0,95. XXXVIII, Аналогич.на стадии III/ А 0,9; ВЫХОД 69,. т.пл. 135 С; R, О 0,64; Rf., 8 0,65; Кг., С О. Ro, пХ г- л Tf- я -л. «. R|, F 0,35; R|, Н 0,19 R, к 0,86. XXXIX-. Аналогична стадии IV. XL.(А 0 - Phe). Раствор 7,2 г (2,8 ммоль)N-бeнзилoкcикapбoнил-Dфенилаланина и 3,б2 г 25 ммоль)L-лейцинметилового сложного эфира в 100 мл этилацетата охлаждают до и к нему добавляют 5,15 г (25 ммоль) дициклогексикарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при с в течение ночи После обычной обработки с последующей перекристаллизацией остатка из смеси этилацетат:петролейный эфир (т.кип.60-80 с) получают дипептид 9,1 г (86%); т.пл. 123-124 0 &iJl)-8. (с, 2,1 в метаноле); Rr, D 0,76; Rj, E 0,б5; Rr, F 0, Rj, H 0,73. XL I. (A D - Phe). Каталитическое восстановление над 5 вес.- палладием на угле Р. этаноле, содержащем 3 один эквивалент хлористого водорода, в течение 5 м. XL II. (A D-Phe). К насыщенному ра створу ,Э8 г (8,36 ммоль) N-бензилокси-карбонил-О-бензил-L-тирозин-2,4,5-трихлорфенильного сложного эфира и 2,5 г (7,6 ммоль) хлоргидрата 0-фенилаланил-1-лейцинметиловог сложного эфира в диметилформамиде до бавляют 1,1 мл ( 7,6 ммоль триэтилами на и перемешивание продолжают в течение ночи при комнатной температуре Хлоргидрат триэтиламина отфильтровывают, и фильтрат упаривают досуха. После перекристаллизации остатка из водного метанола получают производное трипептида с выходом 3,6 г, (69,); т.пл. ISS-IS C; Rr, D 0,82 Rp , Е 0,69; Ro, Н 0,78; R., Р 0,71 R, Q 0,82. XLII. (A D-Phe). Раствор 3, г (5,0 ммоль) описанного в стадии XL I I сложного метилового эфира и гидрата гидразина (60 ммоль) в 30 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение k ч концентрируют до небольшого -объема, гидразид осаждают добавлением 500 мл воды. Отфильтровывают, промывают водой, смесью метанол:простой эфир I: и простым эфиром и сушат. Выход 2,9 (85,91); т.пл. 179-180С; RP, А 0,81 Rr, В 0,79; Кг Rj, Е 0,49; Ri, F 0,65; R., Н 0,67; D Р П 9С. R . П П :П;7 RJ, Р 0,25; R, Q 0,:57. XL IV и XLV.(). 1,83 мл (11 ммоль) раствора 6,02 М хлористого водорода в диоксане добавляют к раствору 1,86 г (2,75 ммоль) N-бензилoкcикapбoнил-0-бeнзил-L-тиpoзил-D-фeнипзлaнил-L-лeйцин гидразида в 5 мл при -20 С, в полученную смесь вводят 0,33 мл (,2,89 ммоль) трет.-бутилнитрита. Спустя 2 мин добавляют-1,89 мл (13,5 ммоль) предварительно охлажденного раствора ( ) триэтиламина и 1,02 г (2,5 ммоль) хлоргидрата N -нитро-Ь-аргнинил-Ь-пролилазаглицин-амида в 10 мл диметилформамида, реакционную смесь перемешивают в течение ночи при С. Получают гексапептидное производное, ко торое чистят колоночной хроматографией на силикагеле (20 г), используя в качестве элюирующих растворителей 5 об.|-ный метанол в хлороформе, 10 об.% метанол в хлороформе и смесь хлороформ:метанол:вода 11:8:2, вы614ХОД продукта 0,7t г (29,3 ), т.мл. 13/ 139С; Rf, А 0,68; Rr, В 0,72; RP, С 0,58; Rr, D U,S2; Rr, Н 0,39: R:, к 0,95. t XLVI, XLVII и XLVIII. L-пироглютaмил-L-гиcтидин-гидpaзид (10 ммол) превращают в азид по способу, описан .ному в общем способе, и соединяют со сложным метиловым эфиром L-триптoфил-L-cepинa (11 ммоль), полученным гидрированием N-бензилоксикарбонильного производного над 5 вес.4 палладием на угле в диметилформамиде при -10 С в течение 30 мин и при С в течение 24 ч. Хлоргидрат триэтиламина отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха.Сырой пептид чистят колоночной хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюирующего растворителя 10 об.;-ный метанол в хлороформе, 20 об. -яый метанол в хлороформе и смесь хлороформ:метанол: вода 11:8:2. Выход продукта т.пл. 142-145 C (с разложением); fl, Л 0,39; Rf, В 0,72; R,., С 0,5; . R, D 0,48; R, К 0,61. XLIX. Раствор сложного метилового эфира L-пироглютамил- Ь-гистидил-Ь-триптофил-Ь-серина (5,4 ммоль) в 70 мл диметилформамида обрабатывают гидразин гидратом ( 1ПО ммоль) в течение 4 ч. Диметилформамид отгоняют в вакууме, остаток растирают с этанолом, отделяют, промывают этанолом и эфиром, сушат. Выход 88,2%,т.пл.184189С; Rf, А 0,18; Rj, В 0,55; , С 0,39; , D 0,27; R-, К 0,58. L. (A D-Trp). 4,87 г (23,6 ммоль) дициклогексилкарбодиимида добавляют к раствору 7,27 г (21,5 ммоль) N-бензилоксикарбонил-О-триптофана, 3.12 г (21,5 ммоль) сложного метилового эфира лейцина и 5,8 г (43 ммоль) 1-гидроксибензотриазола в 50 мл диметилформамида при . Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и обрабатывают обычным способом. После перекристаллизации из смеси этилацетат:петролейный эфир (т„кип. 60-80°с) получают ипептидное производное С 9,55 г), в котором с помощью хроматографии в тонком слое обнаруживают следы примесей. Продукт чистят колоночной хроматографией на силикагеле ГЗОО г/, используя в качестве элюирующего растворителя хлороформ и 5 об.-ный метанол в хлороформе. Выход продукта 15 3,10 г (), т.пл. 151-1530С; R, А О. Rf, В 0,80; Rn, С 0,86; Rp, D 0,78; R, Е 0,61; Rf, F 0,68; Rj, Н 0,73; R, P 0,55; Rf, Q 0,73. LI. (A D-Trp).Каталитическое воестановление в 80 об.2; водном диметил формамиде над 5 вес.% палладием на угл& в течение 5 Чо LI I .(A D-Trp). Раствор П,69 г (20 ммоль) сложного эфира N-бензилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозин-2,4, трихлорфенила, 6,28 г ((19 ммоль сложного эфира 0-триптофил-1-лейцина в 100 мл диметилформамида перемешива при комнатной температуре в течение 60 ч. Реакционную смесь обрабатывают обычным способом и остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат:пе ролейный эфир (т.кип. 60-80 С) получают трипептидное производное с выхо дом г (62,5%)-т.пл.165-166 С; Р.г, А 0,78; Rr, В 0,73; Ro, С 0, Rr, D 0,80; R|, Н 0,62; Rf, F 0,70; R, Н 0,76; R, P 0,58; R, Q 0,68. LI I I. (A D-Trp).7,26r (10,1 ммоль) раствора сложного метилового эфира М-бензилоксикарбоиил-0-бензил-1-тиро зил-О-триптофил-Ь-лейцина в смеси 200 мл метанола и 50 мл диметилформамида обрабатывают гидразин гидратом (100 ммоль) при комнатной температуре Спустя 2k ч раствор концентрируют ( д приблизительно 30 мл) и добавляют 500 мл воды. Трипептидный гидразид отделяют, промывают водой, смесью метанол:эфир 1:А и эфиром, сушат. Получают 6,86 (9,6%) продукта с т.пл. 200-202 0; R., А 0,90; R, В 0,95; Rf, С 0,90; R, D 0, RI, Q 0,59. LIV и LV.(.Trp) . При перемешивании и охлаждении () раствора 1,97 г (2,75 ммоль) N-бензилоксикарбонил-0-бензил-1-тирозил-0-триптофил-1-лейцингидразида в 10 мл димети формамида обрабатывают 1,83 мл (П ммоль) 6,02 М раствора хлористог водорода в диоксане, а затем 0,33 мл (2,89 ммоль) трет.-бутилнитрита. Спустя 2 мин добавляют предварительно охлажденный (-20с) раствор 1,02 (2,5 ммоль) хлоргидрата N -нитро-L-аргинил-L-пропил-азаглицин-амида и 1,89 г (13,5 ммоль),триэтиламина в 10 мл диметилформамида и полученную реакционную смесь перемешивают в течение при . Ее обрабатывают обычным С1гособом, полученный оста1616ток-( 1,27 г) помещают в колонку с силикагелем ( 230 г) и продукт элюируют хлороформом и 5 об,/-ный Метанолом 3 хлороформе. Выход 0,91 г (3,4%); т.пл. 139-1 СС с разложением); RJ, А 0,67; R{, В 0,72; RO, С 0,58; R, О 0,62; Rp, Н 0, Rj, К 0,95. LVI. (А 0:Туг(Ме)).К охлажденному до О С раствору 3,17 г (9,64 ммоль Z-D-Tyr(Me)-OH, 1,92 г (10,6 ммоль) Leu-OMe, НС1, 2,6 г, (19,2 ммоль)1-гидроксибензотриазола и 1,6 мл (11 ммоль) триэтиламина в 30 мл диметилформамида добавляют 2,29 г (11,1 ммоль) N , М-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при с и обрабатывают обычным способом. После перекристаллизации из горячего циклогексана получают защищенное дипептидное производное. Выход 1,41 г (95,2%); R, D 0,83; Rr, Е 0,б9; Rr:, P 0,72; Rr,-Q 0,76Г LVI I. (А 07Гуг(Ме)) .Каталитическое восстановление над 5 вес, палладием на угле в смеси метанол:диметилформамид: вода 8:1:1, содержащей 1,2 эквивалента хлористого водорода, в течение 3 часов. LVIII. (А 0-Туг(Ме)). Раствор (Bzl)-OCp (8,2ммоль).,0-Туг(Ме)--Leu-OMe, НС1 (b,2 ммоль) и триэтиламина (8,2 ммоль) в 60 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, реакционную смесь затем обрабатывают обычным способом. Продукт отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Выход 81,2%; т.пл. 191-192°С; RJ, О 0,85; RI:, 0,73; R, F 0,72; Rj, Q 0,78. LI X.((Me)). Гидразин гидрат (12,9 ммоль) добавляют к раствору 4,59 г (6,4 ммоль) Z-Tyr(Bz1)-0-Туг(Me)-Leu-Me в 25 мл диметилформамида и 50 мл метанола и реакционную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. Метанол отгоняют в вакууме, продукт осаждают водой, собирают, промывают водой и сушат, получают продукт с т.пл. 212-213 0; Rr, Е 0,49; Ri, F 0,66; Rj, Н 0,69; Rr. Q 0.70. LX и LXIо (A D-Tyr(Me)).3,54 г (iJ,0 ммоль) гидразида, полученного на стадии LIX, растворяют в 10 мл диметилформамиде и охлаждают при перемешивании до , добавляют к 173 нему 3,3« мл (20. ммоль) 5,92 М НС1 в диоксане, затем 0,6 мл (5,25 ммоль трет.-бутилнитрита. Спустя 2 мин вво дят предварительно охлажденный раствор 2,0 г (5 MMO/fb)H-Arg(N )-Рго-AzGly-NH HCI и 3,55 мл (25 ммоль ) триэтиламина в 10 мл диметилформамид перемешивание продолжают при в течение ночи. Реакционную смесь обра батывают обычным способом, а получен ный сырой продукт чистят на хроматографической колонке с силикагелем, используя в качестве элюирующего растворителя хлороформ, 5 обД-ную смесь метанола в хлороформе и 10 обД-ный метанол в хлороформе Выход 3,72 г (70,9%); R, А 0,64; R, В 0,72; R, С 0,55; Rr, D 0,66; Rr,F р,АО; R., Н 0,52. , LXII. (A D-Ser(Bu )). Аналогична стадии LVI. Полученный продукт перекристаллизовывают из водного метанола Выход 90, т.пл. 107108С; RP, D 0,80; R, Е 0,68; Rr, F 0,73; Rr, Н 0,72; Ro, Р 0,72; R., Q 0,7t. . LX1II„(A D-Ser(Bu )).Каталитическое восстановление над 5 вес. палла дием на угле в смеси диметилформамид:метанол 8:2 в течение 5 ч, LXIV.(.Ser(But)), Растйор 19,17 г (32,7 ммоль) Z-Tyr (Bzl)-OCp и H-Ser()-Leu-OMe (32,7 ммоль) в 100 мл диметилфопмамида оставляют при комнатной температуре на 72 ч. В результате обычной обработки раствора получают твердое вещество, которое промывают эфиром и сушат. Выхо 17,6 г 79,); т.пл. 135-137 С; R,D 0,80; R, F 0,77; R-{, Q 0,81. LXV. (A D-Ser()) . Аналогична стадии LIX. Перекристаллизация из водного метанола. Выход 56,2%/ т.пл. 13 -136°С; Rr, О 0,66; R, Н 0, Rj, Q 0, LXVI и LXVII.(A D-Ser(Bu)). Аналогичны стадии LV и LXI. Полученный продукт чистят хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюирующего растворителя хлоформ и 5об.-ный метанол в хлороформе. Выход 38, т.пл. Rj, А 0,ЬЦ; R , В 0,71; R , С 0,55; R , О 0,65; R , F 0, R , Н 0,43; R , Q 0,16. LXVII I.(A D-Tyr(Me)). 5,13 г (24,9 ммоль дициклогексилкарбодиимида добавляют к охлажденному ( и перемешиваемому раствору Z-0 -Туг(Ме)-ОН (22,6 ммоль),5,98 г (24,9 ммоль) H-Me-Leu-OMe, НВг, 3,5 мл (24,9 ммоль)триэтиламина и 6,12 г (45,2 ммоль) 1-гидроксибензотриазола в 50 мл диметилформамида и перемешивание продолжают в течение ночи при . Реакционную смесь обрабатывают обычным способом и полученный продукт чистят колоночной хроматографией на силикагеле, используя для элюирования хлороформ. Выход 55,2, масло; R, О 0,83; Rf, Е 0,78; R, Н 0,79; R,P 0,80; Rr, Q 0,79. LXIX.(A D-Tyr (Me)). Каталитическое восстановление над 5 весД палладием на угле в смеси метанол:вода 8:2, содержащей эквивалент хлористого водорода -в течение 6ч. LXX.(A D-Tyr(Ме)). Аналогична стадии LVI I I .. Продукт чистят колоночной хроматографией на силикагеле, используя для элюирования эфир. LXXI . (A D-Tyr(Me)). Раствор 4,85 г (6,69 ммоль) Z-Tyr(Bzl)-D-Tyr(Me)MeLeu-OMe и гидразин гидрат., (120,7 ммоль) в 150 мл метанола выдерживают ночь при комнатной темпе- ратуре. Гидразид осаждают, добавляя воду, отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси метанол:вода. Выход 91,1%; т.пл. 129-131 С; Rn, D 0,79; R, Е 0,60; Rj , F 0,68; Rr, Н 0,73; Rf, Q 0,77. LXXI I и LXXII I. Аналогичны стадиям LX и LXI . I Перекристаллизация из смеси метанолгпростой эфир; выход 23,8%; т.пл. 152-15 °С; Ri. А 0,67; R, В 0,68; R, С 0,58; Rf,D 0,59; R, Н 0,50; R, К 0,94; Rf,Q 0,35la

aXI

ц ю

(О

21

Формула изобретения 1. Способ получения полипептидов фо,

1Лзби - Viis-Trp-eev-T jr-А-В-А1г -Р о-Ег

где если А - D-Tyr; D-Tyr(Me);D-Ser

D-Ser(Bu); D-Phg; D-Ala; D-Trp, TO В -L-Leu; L -Meheu; E -AzGly; F -NH2,

или если A - ArGly; AzAla; TO В - L-Leu;

E - простая связь; F - C2., или их солей,

22

910116

Т а б л и

Ц а

отличающийся тем, что конденсируют пептидные фрагменты

CGLu-His-OH,илиIIGlu-His-Tгp-Seг-OH или их азиды с пептидами

H-Trp-Ser-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F, или H-Tyr-A-B-Arg-Pro-E-F соответственно

значения A,B,F и Е указаны выше, с последующим выделением целевого продукта в виде основания или соли.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

и

His

Trp