Способ отщепления сульфенильных групп от -сульфениламинокислот и сульфенилпептидов Советский патент 1980 года по МПК C07K1/06 C07K7/06 

(54) СПОСОБ ОТЩЕПЛЕНИЯ СУЛЬФЕНИЛЬНЫХ ГРУПП ОТ N-СУЛЬФЕВИЛАМИЯркиеЛОТ И N-СУЛЬФЕНИЛПЁПТИДОВ

- . :: -:--:/:, ,- 1 , ; / ; Изобретение ОТНОСИТСЯ к улучшенному сгюсобу отщепления: сульфёни1пЬ ных защитных Групп у М-сульфенилаМи нокислот и N-сульфёнилпёптйдбв и может; найти примейение в синтезе пеп тидов. . . . В качестве сУльфеНипьных групп в пептидной химий используют о-нитрофенилсульфенильную (Нфс), 2,4-динктрофенйлсульфенильную и пёнтахлор сульфенильНую группы |1 , но наибольшее распространение имеет Нфсэа1ЦиТйая группа. ,. При отщеплении Нфс-группй кйслрТа ми (или другими соединениями, обладающими кислым характером) у П1ептйдов, содержащих остатки; $-ацйла.мино метилцистеина, S-тритилцистейна, триптофана и тирозина, наблюдаются побочйые реакции, связанные с взаймс действием этих остаткс5в с образующимся катионом о-нитрофёнилсульфенйЛИЯ. например, при ртщепленйи Йфсгруппы у М-Нфс-5-ацетаминомётилцис теина хлористым.водородом вместо ожи даемого S-ацетаминометилцисТеина получается S-Нфс-цисТеин 12} . Чтобы избежать этого, в настоящее время для отщеплениЯ сульфенильных групп используют нуклеоЛильные реагенты которые расщепляют сульфениламидную связь без образования реакцирнноспосЬбного катиона сульфенилйя. Для препаЕ)аТивного применения используют тиоамиды. Например тио.ацетамйд, тйобейзамид. Реакцию проводят в оргаНическс 4 растворителе в присутствии кислоты. Н$1 1 моль Нфс-пепТийа или Нфс-аминокислоты (содержащих одну Н с-группу) используют 2 trOf 3 или 4 2} моль тйоацетамида i НйлосТаТкстл известного способа является йсйбльэование большого избыткатиодцетамида, что затрудняет вьщеЛение и очистку деблокированного пептида или аминокислоты прсЛё ртщепЛения Нфс-Г1руппы. Цель приедлагаемого изобретения - упрощение процесса удаления Нфс-защитных f-pynri. Поставленная цель достигается опиctisaeNttJM способом отщепления сульфенильных групп от М-сульфениламинокислот и Н-суЛьфенилпептиДов путем действия на защищенные по тиольной функции М-сульфениламинокислоты N-сУльфенилпептиды тиоамйдом в среде органического растворителя в присутствии кислоты, заключающийся в том. что количественно отщепляют сульФенильную группу действием 0,5-0,6 мо тиоамида на 1 моль М-суль енильног производного.Предпочтительным вариантом спосо 6а является использование в качеств сульфенильной группы о-нитрофенилсульфенильной группы в качестве тио амида-тиоацетамида и тиобензамида, для защиты тиольных функций использ ют S-тритильную группу. Реакцию проводят в инертном растворителе или смеси инертных раство рителей в присутствии слабой кислоть1 (предпочтительно уксусной) для протонирования аминопёптида, напри.MQf), этанол --уксусная кислот;а, эта НОЛ - этийацетат - уксусная кислота Температура проведения реакции , может/быть в пределах от О до 40°С, но предпочтительна комнатная, время проведения реакции 0,5-24 ч,обычно 2-3 ч. Обработку реакционной смеси после .отщепления НФС-группы прово-дят согласно стандартным методам пе тидного синтеза. Способ позволяет сократить расход тиоамида более чем в два раза (4-8 раз) ПО .сравнению с извес.тнйми спос бами отщепления- Нфс-группатйоамида ми 1 и .Экономия реаг.ента облегча етвьщеление целевого продукта и име ет особо важное значение.при отщеплении Ифс-группы и НФС-аминокислот ..после их. разделения на энантиометрЫ различными .ме.тодами (при получении ог1тиЧескй активных аминокисЛ.от из рацематов). . В качестве примера использования тиоамида (тиобензамида).в количестве 0,5-0,6 моль на 1 моль Нфс-соединения приведена методика синтеза дезамйноокситоцина, высокоактивного аШйЬга пептидйоЬо гормона окситоНсрс-ТирHflg - Ofte. Дцгк, Honip .. (в)Нре- Ttip- jje-one ii) -f muoSeffjaHiff 2)(трт )--omp (я I Мпр (Tpmj - Тчр - Me - О fie (Sj Hnp{Tpmj--Tup-Hftt-OH Hcpf- Г f Я

O) Hnp(Tpff)-Tup-Hflt-rnH AcH-T- Цис(Гр/п)- Прв -Лей-Гни- NHi

-f йод /80 % ijKcycHon Kttejtoma (nj Ппр - Tup - пле - rjJH- AcH - цие - Про - Лей - гла нн

На 1 моль НФС-пептида израсходовано 0,5-0,6 моль тиобензамида. W цина. Все промежуточные продукты, получаемБ1е после отщепления Нфс-группы, могут быть использованы также для синтеза окситрцина. или других его аналогов. В качестве S-защиты применена 5 тритильная группа, однако могут быть использованы также S-ациламинометильные группы, Дезаминоокситоцин синтезирован из двух блоков, N-концевого трипептида и С-концевого гексапептида (3+6) , которые получены поостаточным наращиванием пептидной цепи при помощи пентафторфениловых (Опф) эфиров НФС-аминокислот и Опф-эфира S-тритил.-2-меркаптопропионовой кислоты. Соединения 1-10 (см.схему), Опф-эфиры, получаемыеиз соответствующих кислот, дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК) и пентафторфенола, могут быть применены для образования пептидной связи также без их выделения в индивидуальном виде, как в данном примере в случае производных L-глутамина, L-тирозина и..М-концевого трипепт.ида. Активированные эфиры тирозина со свободной гидроксильной группой склонны к межмолекулярнойконденсации, а. активированные эфиры глутамина претерпевают внутримолекулярнуюциклизацию с обр.азованием производных глутаримида. - . Для ускорения завершения реакции образования пептидной связи (аминолиза пентафторфениловых эфиров) к реакционной смеси добавляют 0,5-0,7 эквивалентов третичного основания (N-метилмЬрфолина), которое частично нейтрализует выделяющийся- в реакции кислый пёнтафторфенол. На последней стадии синтеза разбавленный раствор дитритилдезаминоксицина обрабатывают иодом и полуают Дезаминоокситоцин Про- fJeu-Гли- NH2 I -t-MiDC Цис(Трт) - ОПд (ч) С - (Tpmj - Про - лей- Гми - NHz (z) Jl) -h muoSsHSc iuS г)+- Hipc AcH-0 Hp - Цис(т/}т) - fjfo - Леи - Гли - NHj, /J I il} тиобензанид г)л-Н10С-Гпи-ОП1р «) -цис(грт)npo-Jleu-mu-NHg sj -t- muoffHifffrud Oflip

Использованы следующие сокращеия:

НФС - о-нитрофенилсульфенил, 2-нитрофенилсульфенил, о-нитрофенилти о; (Трт)- S-ТРИТИЯ; ОПф - пентафторфениловый эфир; НОПф- пентафторфенол; ДЦКГ- дициклогексилкарбодиймид; АСН-, Гли-, -Глн-, -Иле-, -Лей-, -Про-, -Тир-, -Цис-, Мпр - соответственно L-аспарагинил, тлицил, 1-глутс1минил, L-изолейцил, L-лейцйл, L-пролил, L-тирозил, L-цистеинил, 2-меркаптопропионил. Синтезированный дезаминоокситоцйн проверен на оптическую чистоту путем анализа летучих производных (N-трифторацетилизопропиловых эфиров) аминокислот гидролизата дезаминоокситоцина газо-жидкостной хроматографией с использованием оптически активной стационарной фазы (циклогексилового эфира Н-трифторацетил-(.-норвалил-1 -норвалина). Примеси 0-изомеров не превышали 0,5%, включая производного изолейцина.

При характеристике продуктов температуры плавления определяют в открытых капиллярах без поправки, чистоту продуктов проверяю с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле (пластинки Силуфол,KavaEiег, ЧССР), при этом используют следующие хроматографические системы:

(1)бензол,

(2),эфир,

(3)этилацетат,

(4)хлороформ+метанол+уксусная кислота 85+10+5 (мл),

(5)н-бутанол+уксусная кислота+ +вода 4+1+1 (по объему).

.Для .полупрепаративной хроматографии (при очистке веществ для элементного анализа) также использован силикагель.Применяемые в синтезе 0,1 М раствор серной кислоты, 0,2 М, раствор гидрогенкарбоната натрия, 2 М раствор карбоната натрия являются водными растворами.

Пример 1. Пентафторфениловый эфир о-нитрофенилсульфенил-5-тритил-1-цистеинаг Нфс-Цис(Трт)-ОПф(1).

К раствору 12,1 г (23,4 м моль,мм) о-нитрофейилсульфенил-5-тритил-1-цистеина в 30 мл диоксана охлажденному до 15с добавляют смесь, состоящую из 8,2 мл ЗМ раствора ДЦГК в диоксане и 8,2 мл 3 М раствора пентафторФелола в диоксане. Реакционную смесь перемешивают 3 ч, выпавший ос.адок дициклогексилкарбамида отфильтровывают и промывают его на фильтре диоксаном ( мл). Фильтрат упаривают до маслообразного остатка, который перемешивают с петролейным эфиром ( мм). Растворитель отделяют де-. кантацией, после последней промывки

остаток дополнительно сушат в вакууме (40°С,0,1 fvjM рт.ст.) .Выход за. твердевшего пентафторфенилового эфира (Т) 15,1 .г (90%). т.пл.70-72°С; Rf 0,75 (1)..

Небольшую часть (0,5 г) пентафтор фенилового эфира (I) растворяют в , -бензоле (2,5 мд)и раствор наносят на колонку ( см), наполненную силикагелем, и элюируют бензолом. Собирают первую фракцию, окрашенную в

О желтый цвет, упаривают (40°С) в вакууме растворитель, остаток растирают с петролейным эфиром ( мл) и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия. Выход

5 Нфс-Цис(Трт)-ОПф в процессе хроматографии 80%; т.пл. 77-79°С ;о(3 - 12,0 (с 0,5; диоксан).

Найдено, % : С 60,10; Н 2,95; N 4,02.

0Cj. H2aP5N204Ss 682,69).

Вычислено,: С 59,82; Н 3,40;

N 4,10.

о-Нитрофенилсульфенил-5-тритил-1-цистеинил-Ь-пролил-И-лейцилглициламид, Нфс-Цис(Урт)-Про-Лей-Гли-МН2(2) .

5

К раствору 14,0 г (20,5 мм)Нфс-Цис(Трт)-ОПф (1) в 40 мл диоксана, охл;ажденному до 15°С, добавляют pacfтвор 5,8 г (20,5 мм) 1-пролил-1-лейцилглициламида в 20 мл диметилАорм0 амида. Смесь перемешивают 0,5 ч, затем по каплям добавляют 1,6 мл (70%) N-метилморфолина и оставляют на ночь при комнатной температуре.

Растворители упаривают в вакууме,

5 остаток растирают с этилацетатом (100 мл). Этилацетатный раствор последовательно промывают (3x30 мл) ОД М раствором, серной кислоты, водой, 0,2 М раствором гидрогенкарбо0 ната натрия, водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают (40°с) этилацетат в вакууме. Оставшееся масло перемешивают(35°С )с петролейным эфиром ( Mjri) .

, Растворитель отделяют декантацией, а после последней промывки остаток сушат в вакууме. Выход желтого тетрапептида (2) 14,4 г (90%);т.пл. 120-122°C;tc 3 - 62,2 (с 1,0; диокеан); R 0,55 (4), 0,86 (5).

Найдено, % : С 62,54; Н 5,74;

N 10,26.

% «46 60652 (782,99). Вычислено,%: С 62,89; Н 5,92;

М 10,73.

5 о-Нитрофенилсульфенил-1-аспарагинил-5-тритил-1-цистеинил-1-пролил-1-лейцилглициламид, Нфс-Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-NHrj. (3).

К раствору 14,3 г (18,3 мм) Нфс0 -Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-ЫН,(2) в 60 мл этанола добавляют 1,4 г Гю мм)тиобензамида и после растворения реагента 3. мл уксусной кислоты. Смесь выдерживают при комнатной температуре 5 3 ч, отфильтровывают, выпавший «ел767090ТЫЙ осадок побочных продукто:э. Фильтрат упаривают в вакууме, остаток растворяют в смеси, состотцей из 20 мл эфира и 100 мл ОД М раствора серной кислоты. Эфирный слой отделяют, водный слой, содержащий сульфат аминотетрапептида, экстрагируют эфиром до бесцветного эфирного слоя ( мл) и при 5°С добавляют 2М, раствор карбоната натрия до рН раствора 9,0. Отделяют выпавшее масло аминотетрапептида и промывают его водой ( мл). Водяый слой дополнительно экстрагируют (3x20 мл) смесью, состоящей из хлороформа и этано ла 10+1 (по объему), которую добавляют к маслу аминотетрапептида.После упаривания (35°с) органических растворителей к твердому остатку {11 г 16,5 мм, 90%) аминотетрапептида добавляют 50 мл диоксана, 7,5 г (16,5 мм)пентафторфенилового эфира О-нитрофенилсульфенил-1-аспарагина и после растворения компонентов при добавляют 0,9 мл (8 мм)(у метил морфолина. Смесь перемешивают 5ч, упаривают (40°С) растворители. Ост ток растворяют в 100 мл этилацетата и раствор последов.ательно промывают ( мл) 0,1 М, раствором ..кислоты водой, 0,2 М раствором гидро генкарбоната натрия, водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают (40с) этилацетат в вакууме. После растирания остатка с эфиром (2x30 мл выход пентапептида (3) 13,9 г (90% иэ расчета на аминотетрапептид; 85% из расчета на .защищенный тетрапептид т.пл. 133-134 С; Rr О, io (4), 0,60 (5). Небольшую часть .(0,3г) защищенно пентапептида (3) растворпют в-этано ле (3 мл) и раствор наносят на коло ку (З 12 см) , .наполненную силикаге Лем. Элюируют этанолом, первую фргак цию, О1срашенную в желтый цвет отбра сывают; собирают вторую, основную желтоокрашенную фракцию, упаривают (40°С) растворитель и остаток расти . рают с эфиром ( мл). Выход очищенного защищенного пентапептида 85%; т.пл. 137-139°C;t5 62,9 с 0 диоксан). Найдено, % : С 59,85; Н 5,61; N 12,20; (897,09) . c gHgriN-iOeS i Вычислено,%: С 60,25; Н 5,84; N 12,49. 2. о Нитрофенилсуль Пример фенил-1.-глутаминил-1-аспарагинил-5-тритил-L-цистеинил-L-пролил-L-лейцилглициламид, Нфс-Глн-Асн-Цис(трт) -Про-Лей-Гли-МН (5). В 30 МЛ диоксана суспендируют 6,4 г (21,4 мм) о-нитрофенилсульфенил-1-глутамина, суспензию охлаждаю до 15°С и к ней добавляют смесь, со стоящую из 7,4 мл (22,4 лм) 3 М рас твора дицяклогексилкарбодиимида, а в иоксане и 21,4 мл (64,0 мм) М расвора пентафторфекола в диоксане. еакционную смесь перемешивают при 5°С 6 ч, причем желтый осадок о-нирофенилсульфенил-1-глутамина раствояется и выпадает осадок дициклогекиЛкарбамида, который отфильтровыват, промывают на фильтре диоксаном ( мл) и фильтрат упаривают вакууме до маслообразного остатка. остатку добавляют эфир (50 мл) , тфильтровывают малор.астворимый в фире осадок (1,0 г). Данные элементарного анализа осада согласуются предположением, что садок является имидом о-нитрофенилульфенил-1-глутаминовой кислоты. Найдено,% : С 47,48; Н 4,09; N 14,33.. Вычислено для имида о-нитрофенилульфенил-1-глутаминовой кислоты. С,Н М.ОдЗ (281,29)%: С 46,97; Н 3,94; N 14,94. , Вычислено для Нфс ГлН-ОП H-toFgNVjOsS (465,36) ,%: 1; Н 2,60; N 9,03; аО, Т.пл. 159С (разлож.);Вс 0,35 (2) 0,70 (3). Согласно ИК-спектроскопии нитрильная группа отсутствует. Эфирный раствор упаривают до небольшого объема и добавляют петролейный эфир (80 мл). Выпавшее масло растирают с петролейным эфиром (2x30 мл). Растворитель удаляют сливанием, а после второй промывки упариванием (35°с) в вакууме. Выход третье.го пента.фторфенилового эфира р-нитрофенилсульфенил-1-глутамина, Нфс-Глн-ОПф (4) 7 г (70%)1 0,05 (2) 0,45 (3). В.отличие от амида о-нитрофенил-сульфенил-1-глутаминовой кислоты, активированный эфир Нфс-ГлнОПф. подобно остальным активированным эфйрам/ быстро реагирует со спиртовым раствором аммиака. К раствору 13,8 г (15,4 мм)защищенного пентапептида (З) в 60 мл этанола добавляют 1,2 г (8,5 мм) тиобензамида и после растворения реагента 3 мл уксусной кислоты. Смесь выдерживают при комнатной температуре 3 ч и отфильтровывают выпавший желтый осадок побочного продукта. Фильтрат упаривают(40°с)в вакууме, остаток растворяют в смеси, состоящей из 20 мл эфира и 85 мл 0,1 М раствора серной кислоты. Эфирный слой, содержащий бензонитрил, отбрасывают, водный слой промывают эфиром до бесцветного эфирного слоя () потом при 5°С добавляют 2 М раствор карбоната натрия до рН раствора равным 9,0. Отделяют выпавшее масло аминопентапептида Асн-Цис(Трт)-ПроЛей-Гли-NHa и промывают его водой ( мл). Объединенный водный слой дополнительно экстрагируют ( мл) смесью, состоящей из хлороформа и этанола 10+1 (по объему), которую добавляют к маслу аминопентапептида После упаривания органических раство рителей к твердому остатку (10,7 г, 13,8 мм, 90%) аминопептапептида добавляют 25 мл диметилформамида, 25 м диоксана и после растворения 6,4 г (13,8 мм) Нфс-Глн-ОПф- (4). Смесь пеоемешивают при комнэ.тной температуре 0,5 ч , потом при 15°С добавляют 0,8 мл (7,0 мм) М-метилморфолина и перемешивание при комнатной температуре продолжают 5 ч. Упаривают растворители. Остаток растворяют в 100 этилацетата и раствор последовательно промывают ( 0,1 М раствором серной кислоты, водой, 0,2 М раствором гидрогенкарбоната натрия, водой, сушат сульфатом натрия и упаривают (40°с) этилацетат в вакууме. Выпавший во время экстракции осадок получаемого защищенного гексапептида (5) добавляют к остатку после упаривания этилацетата. Остаток растирают с эфиром (50 мл) и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия. Выход .защищенного гексапептида (5) 13,4 г. (90% из расчета на аминопентапептид; 85% из расчета на защищенный пентапептид); т.пл. 100-102c cS ° 43,7 (с 1,0; диоксан) ;Rn 0,03 (4), 0,38 (5) . Найдено, % : С 57Д4; Н 5,69;. N 13,70. СзоНьо оОюЧ (1025,23). Вычислено,%: С 58,58; И 5,-90; N 13,66. Пример 3.Метиловый эфир о-нитрофенилсульфенил-1-тирозил-1 -изолейцина, Нфс-Тир-Иле-ОМе (6). К раствору 7,4. г (22 мм) о-нитр фенилсульфенил-Ь-тирозина в 20 мл диоксана при 15°С добавляют смесь, состоящую из 8 мл 3 М раствора-дициклогексилкарбодиимида и 24 мл 3 М раствора пентафторфенола в диоксане (избыток пентафторфенола берется дл подавления побочной реакции фенольной гидроксильной группы тирозина с ДЦГК). -Перемешивают 5 мин, добавляют раствор 3,5 г (22 мм) свежеприготов ленного метилового эфира L-изолейцина в 15 мл диоксана и реакционную смесь перемешивают 2 ч при комнатной температуре. По каплям добавляют 5,5.мл (50,,мм) N-метилморфолина и смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. Отфильтровывают выпавший осадок дициклогексилкарбамйда фильтрат упаривают в вакууме до маслообразного остатка, который растворяют в 100 мл этилацетата, и полученный раствор последовательно промывают ( мл) 0,1 М раствором серной кислоты, водой, 0,2 М раствором гидрогенкарбоната натрия, водой сушат сульфатом натрия и упаривают этилацетат в вакууме. Темно-желтое масло перемешивают () с петролейным эфиром ( мл) . Растворитель удаляют сливанием, а после второй промывки осадок дополнительно сушат в вакууме. Выход твердого защищенного дипептида (6) 9,5 г (85%); R 0., 45 (2). Небольшую часть(О,5 г)дипептида растворяют в бензоле (2 мл)и раствор наносят на колонку ( см), наполненную силикагелем. Элюируют бензолом до бесцветного элюата,потом эфиром вымывают основную фракцию.Упаривают эфир и желтый остаток растирают с петролейным эфиром ( мл) . Выход защищенного дипептида после хроматографии 82%; т.пл.ЮЭ-ИО С; .f - 3,4° (с 1,0; диоксан). Найдено, % : С 57,35; Н 6,25; N 8,50. . , (461,54) . Вычислено,%: С 57,25; Н 5,90; N 9,10. Пентафторфениловый эфир S-тритил-2-меркаптопропионовой кислоты, МпрТрт)-ОПф (7) . .К суспензии 8 г (23 мм) S-тритил-2-меркаптопроьионовой кислоты (приготовленной при взаимодействии 2-меркаптопропионовой кислоты с трифенилкарбинолом в среде уксусной кислоты) в 50 мл диоксана добавляют смесь, состоящую ИЗ 8 мл 3 М раствора ДЦГК . в диоксане и 8 f/tn 3 М раствора пентафт.орфенола в диоксане. Реакционную смесь перемешиваю.т 6 ч при комнатной температуре. За это время осадок 5-тритил-2-меркаптопропионовой кислоты постепенно растворяется и выпадает осадок дициклогексилкарбамйда, который отфильтровывают, и. промывают диоксаном ( мл). Фильтрат упаривают в вакууме до маслообразного остатка, добавляют 50 мл петролейного эфира и оставляют при О-С на 24 ч. Отфиль-. тровывают выпавший осадок пентафторфенилового эфира (7) и сушат его в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия. Выход пентафторфенилового эфира (7) 10,5 г (90%); т.пл. 77-79С; ,85 (1) (желтое пятно после опрыскивания пластинки трифторуксусной кислотой) .. После перекристаллизации из метанола т.пл. 82-83с. - Найдено, % : С 65,74; Н 3,66; N 0,12. C,j8Hj9 (514-,52) . Вычислено,: С 65,36; Н 3,72; N 0,10. Метиловый эфир 5-тритил-2-меркаптопррпиоиил-1-тирозил-1-изолейцина, Мпр(Тр-г)-Тир-Иле-Омс (8). К раствору 9,2 г (20 мм)защищенного дипептида (6) в 40 мл этанола добавляют 1,5 г (11 мм) тиобензамида и после растворения реагента 2 мл уксуснойкислоты. Смесь выдерживают при комнатной температуре

|3 Ч и отфильтровывают выпавший желтый осадок побочных продуктов.Фильт- &ат упаривают в вакууме, остаток растворяют в смеси, состоящей из 30 мл эфира и 105 мл 0,1 М, раствора серной кислоты. Эфирный слой отделяют, водный слой раствора сульфата аминодипептида Тир-Иле-ОМе экстрагируют, эфиром до бесцветного эфирного слоя (5)3.0 мл) , потом при добавляют 2 М раствор карбоната натрия до рН раствора равным 9,0. Выпавшее масло аминодипептида экстрагируют этилацетатом (2x20 мл). Этилацетатный слой промывают водой ( мл), сушат сульфатом натрия и растворитель упаривают в вакууме. Остаток, масла (5,9 г, 18 мм, 90%) растворяют в 30 мл диоксана и приДБ с к pactBOpy добавляют 9,3 г (18 мм) Мпр(Трт)-ОПф (7)-: После растворения активированного эфира прикапывают 1,3 мл (13 мм) М-метилморфолина. Смесь перемешивают 6 ч при комнатной температуре, упаривают растворитель и остаток растворяют в 100 мл этилацетата. Этилацетатный раствор последовательно промывают ( мл), 0,1 М раствором серной кислоты, водОй, 0,2 М раствором гидрогенкарбоната натрия, водой, сушат сульфатом натрия и упаривают этилацетат в вакууме. Маслообразный остаток,перемешивают (35°с) с петролейным эфиром ( мл) . Растворитель удаляют сливанием, а после второй промывки дополнительно упариванием в вакууме. Выход твердого защищенного трипептида Мпр(Трт)-Тир-Иле-ОМе (8) 10,8 г, |90% из расчета на Мпр(Трт)-ОПф; ; 85% из.расчета на Нфс-Тир-Иле-ОМеЗ ; т.пл.108-110°С; Rf. 0,42 (2) (оран.жевоепятно после опрыскивания пластинки реактивом Паули) . .После переосаждения из эфира петролейным эфиром т.пл. 110-111 С; (D° ,2 (с 1,0 диоксан). Найдено, % : С71,0б; Н 6,61; N 4,26.

Сье,Нл2 N0.055 (638,83).

Вычислено,%: С 71, 45 ; Н 6,63;

N 4,38. 5-Тритил-2-меркаптопропионил-1. -тирозил 1-изолёйцин, Мпр(Трт)-Тир-Иле (9),

10,7 г (16,7 мм) метилового эфир трипептида (З) растворяют в 60 мл диоксана и при комнатной температур (20°с) при перемешивании добавляют 33,4 мл 0,5 М раствора гидроокиси HaijpHH, потом по каплям в течение 2 ч еще 37 мл 0,5 М раствора гидро. окиси натрия. Смесь перемешивают в течение О,5ч, потом добавлением .1 М раствора серной кислоты доводят реакцию среды до рН равным 7,0 и упаривают (З5с) растворитель до 1/ начсшьного объема раствора. Остаток доводят водой до 60 МП, добавлением

2 М раствора карбоната натрия устанавливают рН 8,0 и этилацетатом (3x15 мл) экстрагируют остатки неомыленного метилового эфира трипептида (8).. Водный слой, содержащий натриевую соль кислоты трипептида Мпр-(Трт -Тир-Иле-ONa , при подкисляют 1 М раствором серной кислоты до рН 3,0. Выпавшее масло кислоты трипептида (9) экстрагируют этилацетатом ( мл). Этилацетатный слой промывают водой ( мл), сушат над сульфатом натрия .и растворитель упаривают в вакууме. Маслообразный остаток переосаждают из эфира (20 мл) добавлением петролейного эфира (60 мл). Отфильтровывают осадок, промывают его на фильтре петролейным эфиром (2Х.20 мл) и сушат в вакууме (0,1 мм рт.ст.).Выход трипептида (9) 7,4 г (70%) (2); т.пл. 148-150 С , (с 0,5; диоксан) ;R 0,30 (2) (оранжевое пятно после опрыскивания пластинки реактивом Паули). Найдено,. % : С 70,87; Н 6,37;

N 4,48.

Сг,7 Ч В (624,81).

С 71,13; Н 6,45;. Вь числено,%:

N .4,48.

К раствору 13,3 г (13 им)защищенного гексапептида (5) в 60 мл этанола доб.авляют 0,93 г (6,7 мм) тиобензамида и, после растворения реагента 3 мл уксусной кислоты. Смесь выдерживают при. комнатной температуре 3ч и отфильтровывают выпавший осадок побочных продуктов. Фильтрат упаривают в вакууме; остаток растворяют в смеси, состоящей из 20 мл эфира и 75 мл 0,1 М раствора серной кислоты. Водный слой экстрагируют эфиром до бе.сцветного эфирного слоя ( мл), потом при 5°С добавляют 2 М раствор карбоната .натрия до рН водного слоя 9,0. Отделяют выпавшее масло аминогексапептида Глн-Асн-Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-ЫН, и промывают его водой (2.10 мл) . Водные слои дополнительно экстрагируют (3x20 мл) смесью, состоящей из хлороформа и этанола 10+1 (по объему), которую добавляют к маслу аминогексапептида. Быстро упаривают(30°с)органические растворители, твердый остаток (10,7 г, 11,7 мм, 90%) аминогексапептида- при растворяют в 30 мл диметилформамида, добавляют раствор 7,3 г (11,7 мм) кислоты трипептида (9) в 20 мл диоксана и еще смесь, состоящую из 4 мл 3 М раствора ДЦГК в диоксане и 12 мл 3 М раствора пентафторфено.ла в диоксане. Смесь остав ляют при 10с на ночь. Отфильтрорывают выпавший осадок дициклогексилкарбамида, промывают его на фильтре диоксаном (ЗМО мл). Фильтрат упаривают в вакууме до маслообразного остатка, к которому добавляют 50 мл эфира. Отфильтровывают, осадок защищенного нонапептида (10), промывают его эфиром (3tlO мл) и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия.Выход защищенного нонапептида (10) 13,4 г (78% из расчета на кислоту трипептида; 70% из расчета на защищенный гексапептид) ;т.пл. 148-150 С; R, 0,04 (4) 0,67 (5) (обнаружение реактивом Паули и хлорбензидиновым реактивом). Небольшую часть (0,5 г) защищенного нонапептида (10) растирают горячим- этанолом (5 мл). После охлаждения отфильтровывают осадок (0,4 г) и ра1створяют его в метаноле (5 мл). Метанольный раствор защищенного.нонапептида Наносят на колонку (3 х х12 см) наполненную силикагелем и элюируют метанолом (50. мл). Фракции, К.оторые, согласно анализу тонкослойной .хроматографией I содержат защищенный нонапептид объединяют, растворИтел.ь упаривают в вакууме, Остаток ра. стирают с эфиром потом водой и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью натрия. Выход защищен-, ного нонапептида при очистке 50% т. пл. 15 4-15 5 С-, 35,.0,5; диоксан). Найдено , % : С 65,58; Н 6,40; N 9,99. Cai Hj5g N1, (1478,86) . . Вычислено,%: G 65,79; Н 6,47 N 10,42. Циклический дисульфид (1-6) - каптопропионил-и-тирозил-1-иэолейцил-1-глутаминил-1 аспарагинил-1цистеинил-L-пролил-1-лейдилглии,иламида дезаминоокситоцин, Мпр-Тир-Иле-Глн-Асн-Цис-Про-Лей-Гли-МН,2 (11). 2,21 г (1,5 мм) защищенного номапептида (10) растворяют в 2 л 80%-но го водного раствора уксусной кислоты и в один прием добавляют раствор - 0,9 г (7,0 мг-атомов) иода в 0,2 л 80%-ного водной уксусной кислоте. Смесь перемешивают при комнатной тем пературе 1 ч. Затем желто-коричневый раствор титруют 0,1 М водным раствором двуокиси серы до обесцвеч вания, .и упаривают () в. вакууме до 1/5 части начального объема. Раствор пропускают через колонку, наполненную анионитом АВ 17x8 в ОН или ацетатной форме (20 мл). Аниони промывают водой ( мл) и объединенный элюат упаривают до небольшого объема (5 мл) и лиофилизируют. Полученный порошок, содержащий дезаминоокситоцин и трифенилдикарбинол растирают с эфиром ( мл) и оста ток (1,1 г) очищают распределительной хроматографией на Сефадексе в системе н-бутанол+бензол+вода содержащей 3,5%-ной уксусной кисло- ты и 1,5% пиридина (1+1+2). Выход дезаминоокситоцина (11) 0,44 г (30% из расчета на защищеяный нонапептид) т.пл. 176-182°С;|о(- 90° (с 0,5; 1,0 М. водный раствор уксусной кислоты) . Утеротоническая активность у крыс (в отсутствии ионов магния) 600t70 международных единиц в мг. вещества. Пример 5. Уточнение времени отщепления Нфс-группы у Нфс-пептидов. . . - . ЮО MKMOJib соответствующего пептида (см.таблицу) растворяют в 0,4 мл этанола, добавляют 8 мг (58 мкмоль) тиобензамида и 0,02 мл уксусной кислоты. Смесь вЬщёрживают при комнатной температуре (20°С)и с интервалами 10 мин берут 1 мкл раствора и проводят хроматографирование на пластинках СЙлуфол. Для сравнения проводят хроматографирование эталонного раствора, содержащего 5 мкмоль пептида в.смеси О,4 мл этанола и 0,02 мл уксусной кислоты. Время отщепления БФс-группы (не более 95% исходного Нфс-пептида) определяют сравнением э1 стинкций желтых пятен тех исходных пептидов и эталонного раствора. Сравнение проводят при помощи прибора ,RТ 65 М (ГДР) с фильтром 400 им. НФС-ГЛН-АСН-Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-амидНфс-Асн-Цис(Трт)-Про-Лей-Гли-а.мид Нфс-Цис(Трт)-Про-Лей-ГлиХроматографические системы: 1 - бензол, 2 - эфир, 3 - этилацетат, 4 - хлороформ - метанол - уксусная кислота 85+10-f5 (мл) ;-Rf тиобензамида желтое пятно 0,5 (1);0,65 (2);0,72 .(3) ;0,83 (4). .7 Пример 6. Отщепление Нфс-группы от НФС-аминокислоты действи ем тиобензамида или тиоацетамида. 28 мг (100 мкмоль) Нфс-1-лейцина растворяют в 0,4 мл этанола; добавляют 8 мг (58 мкмоль) тиобензамида и 0,02 мл уксусной кислоты. Время .отщепления Нфс-группы определяют,как описано ранее, оно составляет менее 10 мин.Я Нфс-1-лейцина В еистё.ме (2) 0,8. Опыт бтщёплён йяНфс-группы у Нфс-1-лейдина повторяют с 4,4 мг ;(59 мкмоль) тиоацетамида. Бремя от щёпленйя НФС-группытakJKe составляет менее 10 мин. ; .,.. Формула изобретения .. 1. Способ отщепления сульфенильных групп, от N-сульфениламинокислот и М-сульфенилпептИдов путем де1Йствйй на защЩенныё по тйольнoS yTTKции N-сульфеНиламинбкислоты и N-сульфенилпептйды. тиоамйдом и среде 6рганич:еско1 6 растворителя в прйсутс№йи кйсЛотЫ, о /т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с Целью упрощения про цесса. , используют 0,5-0 ,6 моЖ тйоамида на 1 моль М-сульфейЙйьного .производного. .; 2. Способ по п,1, о, т ли чаю Щ и и с Я; Тем, что в качестве сульфенильной группы отщепляют о-нитрофенилсульфенильную группу. 3.Способ по П.1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что в качестве тисамида используют тиоацетамид иди тиобензамид. . . - ... ; -1 4.Способ по П.1, о т ли ч .а ю щ и и с я тем, что используют N-сульфениламинокислоты и М-сульфенилпептиды, защищенные по тиольной функции 1-тритйльной группой. Исто.чвики информации, принятые во внимание при экспертизе l..Synthese von fepttden . (Hg.E.Wunsh)iTeiГ 1, Methoden der OrganTschen с hem I e, Houben We f I , (Hg.E.), Bd 15/1,G.Th1 erne, Stutaart, 1974, c.203. 2.Moroder L.,Marchiori F.,Borin G Scoffon e E. Studies on cytochrome C.Partu , Synthesis of the Protected Heptapeptide (Sequence 17-23) of Bakers Jast so-I-cytochromec, Biopolymers, 1973, 12,c.493 (прототип) . 3.Kessler W.JseUn B.,SeIektive spaltunq subtituier.ter Phenylsylf eny I-Schu tzg ruppen bei Peptidsynthesen, Helv. Chlm . Acta , 1966 ,49, C.1330.