Гептапептид в качестве стимулятора памяти пролонгированного действия Советский патент 1982 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретнее к гептапептиду формулы Met-GEu-Hls-Phe-Prc-G y-Pro, (1 являющемуся стимулятором памяти про лонгированного действия. Известен гептапептид - фрагмент АКТГ,.о фор мулы Met-GEu-Hfs-Phe-Arg-Trp-GEy, обладающий психофармокологической активностью, в частности способност стимулировать память 1. Известен ряд аналогов фрагмента АКГТ..., обладающих более высокой по сравнению с нативным фрагментом АКТГ л.-/((7 психофармакологической активностью 2. К недостаткам известных соединений следует отнести быструю потерю биологической активности за счет ферментативной деградации. Цель изобретения - расширение ар сенала стимулирующих память средств обладающих пролонгированным действием. Поставленная цель достигается гептапептидом формулы Het-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro. Синтез гептапептида формулы ( I ) осуществляют известным методом З, путем ступенчатого наращивания пептидной цепи, начиная с С-концевого дипептида с помощью дициклогексилкарбодиимида с добавкой оксибензотриазола с последующим отщеплением защитных групп трансферным гидрированием 1 ,+-циклогексадиеном в присутствии палладиевой черни. Принятые сокращения: Вое - трет-бутилоксикарбонильная группа BzE - бензильная группа ВТ - оксибензтриазол ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид ДЦМ - дициклогексилмочевина ДСНА - дициклогексиламмониевая соль ТГФ - тетрагидрофуран

ТФУ - трифторуксусная кислота

ТФА - трифторацетат

ТЭЛ - триэтиламин

ЦГД - 1,-циклогексадиен

ЭА - этилацетат

Контроль за синтезом пептидов проводят на пластинках марки Силуфол при опрыскивании раствором нингидрина или толидиновым реагентом, после обработки хлором в системах растворителей 1) н-бутанол: уксусная кислота: вода (5:1:2), 2) хлороформ:метанол ( Н: 1 ), 3) н-бутанол:уксусная кислота:пиридин:вода (30:6:20:24 } -, ( ) хлороформ:метанол:аммиак (10:5:1); 5) изобутанол: ацетон:12%-ный аммиак (5:3:2); 6)изопропанол:муравьиная кислота:вода (20

:1:5).

Все растворители абсолютируют соответствующим образом. Точки плавления не корректируйте Целевой продукт после отщепления защитных групп подвергают кислотному расщеплению кипячением в 6н. НСЕ в течение kB ч затем исследуют в сметеме растворителей 5 и 6 двухмерной хроматографией (fingerprint). Продукт гидролиза соответствует содержанию всех аминокислот, входящих в состав пептида. Оптическое вращение измеряют на цифровом поляриметре марки Perkin-Elmer o

Пример 1. Получение гептапептида формулы (l).

I . Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонилпропилпролина

Boc-Pro-G1v-Pro-OBzВ.

675 мг (З, ммоль) Вос-Рго-ОН растворяют в 10 мл ТГФ, добавляют 75 мг (3,1 ммоль) ВТ, охлаждают до 0°С и добавляют 710 мг (ЗЛ2 ммоль) ДЦГК в 5 мл ТГФ„ После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре к реакционной смеси добавляют четырьмя порциями в течение 2 ч раствор бензилового эфира ТФА H-Gly-Pro (3,1 ммоль) и О, мл (3,1 ммоль) ТЭА в 10 мл ТГФ. Реакционную смесь оставляют на 3 сут при комнатной температуре, затем отфильтровывают ДЦМ, раствор упаривают в вакууме, остаток растворяют в ЗА. Этилацетатный раствор промывают 0,1 М раствором НСВ, HijO, раствором NaHCO, H,jO, а затем высушивают над MgSO и упаривают в вакууму о Оставшееся масло растирают с абс.эфиром, при этом постепенно отделяется порошкообразный осадок,, который отфильтровывают и высушивают в вакууме.

Выход 750 мг (531). Т.пл. 120122 °С. ,65 (1); 0,7 (2).

tj . Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланина, Boc-His-Phe-OBzE синтезируют из 10 ммоль N-трет-бутилоксикарбонилгистидйна и 10 ммоль П -толуолсульфоната бензилового эфира фенилаланина методом, описанным на I стадии с выходом 88%, Т.пл. . RJ. 0,836 (3); 0,3 (1). 1

N1, N-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланин

Boc-His-Phe-OH.

350 мг (0,76 ммоль) Boc-His-Phe-OBzF растворяют в 5 мл метанола, добавляют 0,5 мл уксусной кислоты, катализатор - палладиевая чернь и гидрируют при комнатной температуре в течение 10 ч. После отфильтровывания катализатора и многократного прог 1Вания метанолом раствор упаривают в вакууме и остаток обрабатывают эфиром. Отделившийся осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме.

Выход 270 мг (76%). Т.пл. 173- . ,35 (1).

ly . Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонилгистидил-фенилаланилпропилглицилпролина

Boc-His-Phe-Pro-r.Ey-Pro-OBzB. 500 мл Boc-Pro-GEy-Pro-OBzg суспензируют в 3 мл , добавляют 3 мл ТФУ и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, упаривают и к оставшемуся маслу добавляют абс.эфир. Постепенно при выдерживании в холодильнике отделяется осадок. Эфирный слой сливают и проаывают осадок несколько раз декантацией абс.эфиром. Высушивают в ва-. куум-эксикаторе.

Выход количественный. ,01 (1); 0,085 (2).

Из мг (о,51 ммоль) полученного трифторацетата бензилового эфира глицилпролина и 250 мг (0,62 ммоль) N-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланинл методом, описанным на стадии I , синтезирован бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланилпропилглицилпролина с выходом 72%о Т.пл. 1бО-1б2°С. ,27 (1); 0,08 (2). 5 . Бензиловый эфир N-трет-бутилокси карбонил-1р-бензил глутамилги тидилфенилаланилпролилглицинпролина. Boc-GFu-(OBzf)-His-Phe-Pro-GEy-Pro-OBzF.. 260 мг (0,50 ммоль) Boc-GbCOB -ОН ОСНЛ суспензируют в 10 мл эф ра, добавляют 4 мл 0,2 н. и многократно встряхивают в делите ной воронке для удаления ДСНА. Вос -СВи(ОВгГ)-ОН при этом растворяет ся в эфире, Эфирнь й слой отделяют от водного и многократно промывают водой до рН 7« После высушивания . над MgS04 эфирный раствор упаривают в вакууме и оставшееся масло высушивают в вакуум-эксикаторе. Boc-Hls-Phe-Pro-GFy-Pro-OBze суспензируют в 3 мл СН-С2|, добавляют 3 мл ТФУ, оставляют на 30 мин ПРИ комнатной температуре и упарива ют в вакууме., К остатку добавляют абс.эфир и помещают в холодильник.Выпавший осадок отделяют от эфирного слоя, несколько раз промывают абс. эфиром и сушат в вакууме. В итоге с выходом 9U получают 2ТФА-Н-Н15-РЬе-Рго-СВу-Рго-ОВ2Е. ,10 (1); 0,06 (2). Далее Boc-GFu(OBzF)-OH растворя ют в ТГФ, добавляют 50 мг (0,37ммол ВТ, охлаждают до 0°С,прибавляют 80 мг (0,39 ммоль) ДЦГК в 3 мл ТГФ и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее прибавляют четырьмя порциями в течение 2 ч 300 мг (0,31 ммоль) 2ТФА-Н-Н15-Phe-Pro-GJy-Pro-OBzF. Реакционную смесь перемешивают 3 сут при комнатной температуре и обрабатывают аналогично стадии I , Выход 250 мг (76,5%). Т.пл. 168170°Г,. ,30 (1); 0,01 (2). 5. Бензиловый эфир N-трет-бутило сикарбонилметионил-У-бензилглут амил гистидилфенилаланилпролилглицилпрол на Boc-Met-GFu(OBzF)-His-Phe-Pro-GFy-Pro-OBzFПoлyчaюt из Boc-Met-OH ОСНА и Boc-GFu(OBzF)-Hls-Phe-Pro-GBy-Pro-OBzE методом, описанным на стадии Y, с выходом 58%. Т.пл. 98-1ПОС. ,8 (3); 0,79 .С); ,,12; АсОН) П Vjl . М-трет-бутилоксикарбонилметионилглутамилгистидилфенилаланилпролилпролинBoc-Met-GEu-His-Phe-Pro-GFy-Pro-ОН. 75 мг (о,062 ммоль) Boc-Met-nPy(OBzF)-Hi5-Phe-Pro-GFy-Pro-OBzF кипятят в 0,5 мл этанола и 0,5 мл 1 ,А-циклогексилдиена в присутствии 15 мг палладиевой черни в течение 2 ч. Затем катализатор отфильтровывают и многократно промывают этанолом. Объединенный фильтрат упаривают. Остаток растворяют в 0,5 мл абс. метанола и осаждают добавлением абс. эфира. Выход 8 мг (76%). ,26 (1); 0,96 W. У((. Метионилглутамилгистидилфенилалаьилпролилглицилпролин, Boc-Met-GEu-Hls-Phe-Pro-ВЕу-Рго-ОН растворяют в 0,5 мл 1 н НСР/АсОН и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Затем добавляют абс.эфир, выпавший осадок отфильтровывают, промывают несколько раз абс. эфиром и высушивают в вакууме. В итоге получают 25 мг (57) H-Met-Gfu-His-Phe-Pro-GEy-Pro-OH, ,09 (1); 0,94 (Ю; Wf -67,55° (C-Q,, АсОН). Аминокислотный анализ: Met 0,93 (1,0), GFu 1,00 (1,0); His 0,96 (1,0); Phe 1,00 (1,0); Pro 1,80 (2,0); GFy 1,10 (1,0). Проводили сравнение природного фрагмента АКТГд 0И гептапептида формулы (l) по способности стимулиРовать память у животных. Исследуемые пептиды вводили внутрибрюшинно в водном растворе самцам нелинейных белых крыс весом 150-200 г за 30 мин и за 1 ч до, момента обучения. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Обучение крыс проводили в Т-образном лабиринте с пищевым подкреплением: крыс в течение дн обучали находить пищу.в Т-образном лабиринте. При этом фиксировали время, необходимое для поисков и скорость обучения животкшх. Полученные результаты приведены в таблице.; Количество невыполненных реакций у крыс, которым вводили аа час до обущения H,jO, 0,015мг/кг| и гептапептид формулы Д) 0,015мг/кГ. Из таблицы видно, что внутрибркниинное введение гептапептида фор лы (, I) в дозе 0,015 мг/кг а 1 ч до обучения достоверно снижает чис ло невыполненных реакций, т.е. ускоряет обучение. Природный пептид АКТГ 4-(0 Р введении через 1 ч сказался неэффективным. Таким образом, гептапептид формулы U) обладает пролонгированным действием при стимуляции памяти жи вотных по сравнению с природным фр ментом АКТГд.. формула изобретения Гептапептид формулы Met-GFu-His-Phe-Pro-GEy-Pro В качестве стимулятора памяти пролонгированного действия. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1,Ашмарии И.П.,Еропкин М.Ю., Ковалева Т.Д., Рожанец В.В. Олигопептиды мозга - анальгетики, стимуляторы памяти и сна, - Молекулярная биология, TJ2, № 5, с,965-979 (1978), 2,Патент США N 3853836, кл. 260/112,5 R. 197. 3,Химия полипептидов. Под, ред. П,Катсояниса. М., Мир, 1977,