ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ, АНТИТРОМБОЦИТАРНОЙ И АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2006 года по МПК A61K38/00 A61P7/02 

Изобретение относится к медицине, к средствам, обладающим антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью.

Известным средством антикоагулянтного действия является гепарин (Zaman S.M., Neiring P., Gandhi M.R., Gaines P.A. The pharmacokinetics and US usage of heparin in vascular intervention // Clin.Radiol. 1996. V 51. №2. P.113-116) [1]. Его применяют путем подкожного внутримышечного введения.

Однако гепарин не обладает антитромбоцитарной и фибринолитической активностью. При передозировке гепарина его высокомолекулярные фракции вызывают нежелательные побочные явления кровоточивости.

Известно, что ацетилсалициловая кислота обладает антитромбоцитарной активностью (МсКее S.A., Sane D.C., Deliargyris E.N. Aspirin resistance in cardiovascular disease: a review of prevalence mechanisms. and clinical significance // Thromb. Haemost. (Schattauer). 2002. V.88. №5. P.711-715) [2].

Однако она не обнаруживает антикоагулянтно-фибринолитической и антитромботической активности и вызывает нежелательные побочные явления - кровоточивость со стороны желудочно-кишечного тракта.

Известен плазмин. обладающий фибринолитической активностью (Gitabert J.. Estelles A., Grancella S., Espana F., Aznar J. Fibrinolytic system and reproductive process with special reference to fibrinolytic faiture in preeclampsia // Hum.Reprod. 1995. V.10. Suppl.2.P.121-131) [3].

Однако он не проявляет антикоагулянтной, антитромбоцитарной и анитромботической активностей.

Известны пептиды, продукты расщепления фибриногена, обладающие антитромботической, антитромбоцитарной активностью и вызывающие локальный фибринолиз (Standker L., Sillard R., Bensch K.W., Ruf A., Raida M., Schulz-Knappe P., Shenky A.G., Patscheke H., Forssmann W.-G. In vivo degradation of human fibrinogen Aα: detection of cleavage sites and release of antithrombotic peptides // Biochem.biophys.research communications. 1995. V.215. №3. P.826-832) [4].

Однако данные известные пептиды не обладают антикоагулянтной активностью.

Известны пептиды Gly-Pro, Trp-Pro, Pro-Gly, Gly-Pro-Gly-Gly и Pro-Gly-Pro, обладающие антикоагулянтной и фибринолитической активностью (В.Е.Пасторова, Л.Я.Ляпина. Т.Ю.Смолина. И.П.Ашмарин. Антикоагулянтные и фибринолитические эффекты некоторых пролинсодержащих пептидов. Известия АН. Серия биологическая. 1998. №3, с.390-394) [5].

Однако все эти пептиды не обладают антитромбоцитарной и антитромботическрй активностью.

Известны пептиды Pro-Gly и Pro-Gly-Pro, обладающие антитромбоцитарной активностью (В.Е.Пасторова, Л.А.Ляпина, И.П.Ашмарин, Р.У.Островская, Т.А.Гудашева, Э.В.Луговской. Фибриндеполимеризационная активность и антитромбоцитарный эффект циклического и линейных коротких пролинсодержащих пептидов. Известия АН. Серия биологическая, 2001, №5, с.593-596) [6].

Однако данные известные пептиды обладают слабым антикоагулянтным действием.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является расширение спектра действия и эффективности пептидов, рекомендация к применению группы пептидов, обладающих, комплексом свойств: антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью.

Указанный технический результат достигается тем. что пептиды общей формулы:

Х-Pro-Gly-Pro, где

X=Arg-,

Phe-,

Lys-Pro-Arg-,

Glu-His-Phe -,

обладают антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Синтез ниже представленных пептидов осуществляли методами классической пептидной химии в растворе. При синтезе использовали производные L-аминокислот. Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (Чехия). Вещества обнаруживали в УФ-свете, с помощью нингидрина, реагентов Бартона, Паули и Рейнделя-Хоппе, о-толидина в среде хлора. Удельное вращение определяли на поляриметре марки "А1-ЕПО". Проверку гомогенности пептида проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Все растворители соответствующим образом абсолютировали. Точки плавления не корректировали.

Приведены хроматографические подвижности (Rf) в системах растворителей: бутанол: уксусная кислота:вода (4:1:1) (1); этилацетат:ацетон: 50% уксусная кислота:вода (2:1:1) (2); бензол:этанол (8:2) (3); хлороформ:метанол:аммиак (7:2.5:0.5) (4); хлороформ:метанол:аммиак (6:4:1) (5); хлороформ:метанол:уксусная кислота (42:7:1) (6); ацетон:бензол:уксусная кислота (50:100:1) (7); хлороформ:метанол (9:1) (8); гексан:ацетон (3:2) (9); метанол (10); бутанол:уксусная кислота:пиридин:вода (30:6:20:24) (11); хлороформ:метанол (14:1) (12); изопропанол:муравьиная кислота:вода (20:5:1) (13); этанол:аммиак (7:3) (14). После приведенных величин Rf в скобках указан номер системы растворителей.

Принятые сокращения:

Вос - трет-бутилоксикарбонил

ДМФА - диметилформамид

ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид

ДЦМ - дициклогексилмочевина

ОБТ - оксибензотриазол

OBzl - бензиловый эфир

OBu^t - трет-бутиловый эфир

OEt - этиловый эфир

ОМе - метиловый эфир

OPfp - пентафторфениловый эфир

PivCl - пивалоил хлорид

Z - бензилоксикарбонильная группа (КБЗ)

ТГФ - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФУ - трифторуксусная кислота

ТЭА - триэтиламин

ЭА - этилацетат

Пример 1. Синтез Arg-Pro-Gly-Pro.

I. Boc-Pro-Gly-OEt. Boc-Pro-OH 8,3 г (3,45 ммоль) растворяли в 50 мл СН₂Cl₂, охлаждали до +5°С, добавляли 38,45 ммоль (5,38 мл) ТЭА. Реакционную смесь охлаждали до -25÷-30°С. При этой температуре из пипетки прибавляли 38,45 ммоль (4,84 мл) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Температуру реакционной смеси удерживали в интервале -18÷-20°С 20 минут. Одновременно готовили раствор 5,9 г (42,3 ммоль) избыток 1,1 HCl-H-Gly-OEt в 75 мл хлороформа, содержащего 5,92 мл ТЭА. Раствор охлаждали до -25°С и, после образования смешанного ангидрида в первой колбе ее содержимое приливали сразу же к раствору эфира. Реакционную смесь выдерживали 1 час при температуре -10°С и затем 12 часов при температуре +4°С при перемешивании на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, добавляли 250 мл этилацетата, раствор этилацетата промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н. HCl, 3 раза по 25 мл Н₂О, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, отфильтровали и упаривали. Остаток высушивали в вакууме над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход - 10,2 г (30,3 ммоль) 78,83%

Rf - 0,5 (7); 0,862 (8)

Т.пл. 68-70°С.

II. Boc-Pro-Gly-N₂H₃. Boc-Pro-Gly-OEt 10,2 г (30,3 ммоль) растворяли в 80 мл абсолютного метанола, добавляли 4-х кратный избыток гидразин-гидрата 5,88 мл (121,2 ммоль). Перемешивали 12 часов на магнитной мешалке при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, два раза упаривали с эфиром, остаток заливали эфиром (˜5 мл) и оставляли в холодильнике на ночь (для лучшей кристаллизации добавляли затравку). Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили в эксикаторе.

Выход - 6,9 г (20,79 ммоль) 68,62%

Rf - 0,284 (7); 0,474 (8); 0,189 (9)

Т.пл. 98-100°С.

III. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl. К охлажденному до -20°С раствору Boc-Pro-Gly-N₂H₃ 4,7 г (14,6 ммоль) в 40 мл ДМФА добавляли 58,4 ммоль (4-х кратный избыток) раствора хлористого водорода в этилацетате и сразу же 1,73 мл (14,6 ммоль) свежеперегнанного трет-бутилнитрита, реакционную смесь перемешивали 30 минут при -5°С. Реакционную смесь охлаждали до -40°С и добавляли охлажденный до -10°С раствор 8,2 мл (58,4 ммоль) ТЭА в 4 мл ДМФА; когда температура реакционной смеси повышалась до -20°С, добавляли 3,7 г (15,3 ммоль) избыток 1,05 HCl-H-Pro-OBzl в 20 мл ДМФА и 2,14 мл ТЭА. Выдерживали при 4°С 24 часа, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в 200 мл этилацетата и промывали 2 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂O, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О. Этилацетатный слой высушивали над MgSO₄. Упаривали, остаток заливали небольшим количеством эфира (-10 мл). Оставляли в холодильнике для кристаллизации. Для лучшей кристаллизации продукта добавляли затравку. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре небольшим количеством эфира. Сушили в эксикаторе.

Выход - 5,358 г (11,65 ммоль) 79,92%

Rf - 0,326(7); 0,947 (8); 0,390 (9)

Т.пл. 125-126°С

[α]_D ²²=-101,18° (с=0,85; СН₃ОН).

Элементный анализ: С 62,89(62,73); N 9,21(9,14); Н 7,52(7,24).

IV. ТФА·H-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5,358 г (11,65 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 29,13 мл хлористого метилена, добавляли 29,13 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход - 4,63 г (9,7 ммоль) 98%

Rf - 0,043 (7); 0,247 (8); 0,018 (9).

V. Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl. 3,09 г Boc-Arg(NO₂)-OH 9,7 ммоль растворяли в 50 мл ТГФ и 10 мл ДМФА, добавляли 2,07 г (10,67 ммоль) ДЦГК, охлаждали до 0°С, перемешивали в течение 40 минут и добавляли раствор ТФА·H-Pro-Gly-Pro-OBzl в 50 мл ТГФ и 4,46 мл (9,7 ммоль) ТЭА. Перемешивали реакционную смесь в течение трех суток. Отфильтровывали осадок ДЦМ, упаривали раствор в вакууме, к остатку приливали 200 мл гексана, при этом отделялся целевой продукт в виде масла, которое растворяли в 500 мл этилацетата и промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н. HCl, 3 раза по 25 мл Н₂O, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и упаривали. Остаток растворяли в ЭА и высаждали сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме над P₂O₅/KOH и парафином, меняя несколько раз осушитель.

Выход - 4,76 г (7,9 ммоль) 85%

Rf - 0,44(1); 0,8 (11)

Т.пл. 108-110°С

[α]_D ²² - 77,8° (с=0,5; СН₃СООН).

VI. Boc-Arg-Pro-Gly-Pro. 4,76 г (6,5 ммоль) Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, добавляли 1 мл 1 н. соляной кислоты и 4,67 г катализатора -10% окись палладия на нейтральной окиси алюминия, гидрировали в токе сухого водорода при комнатной температуре и давлении 1 атм в течение 6 часов. Затем катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Объединенный фильтрат упаривали досуха. Остаток высаждали из абс. метанола эфиром. Сушили в вакууме, несколько раз меняя осушители.

Выход - 4,23 г (5,8 ммоль) 89%

Rf - 0,125 (4); 0,57 (6); 0,37 (5)

Т.пл. 123-125°С.

VII. Arg-Pro-Gly-Pro. 4,23 г (5,8 ммоль) Boc-Arg-Pro-Gly-Pro-OH суспензировали в 10 мл 2 н. соляной кислоты в диоксане и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляли сухой эфир, выпавший осадок промывали декантацией сухим эфиром. Переосаждали из абсолютного метанола эфиром. Полученный осадок растворяли в 7,5 мл 30% этанола и наносили на колонку со смолой Амберлист А-21 (AcO^--форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюировали пептид 200 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход - 3,69 г (4,93 ммоль) 85%

Rf - 0,287 (4); 0,145 (5); 0,338 (14)

Т.пл. 120-122°С.

Результаты ВЭЖХ: Колонка Supercosil ABZ+Plus размер 4,6×250 мм; скорость потока 1 мл/мин; Элюент A: NH₄H₂PO₄+Н₃PO₄ (50 mM, рН 2.8); элюент В: МеОН

Градиент: 0-20 мин (0-40%В); время выхода 21,21 мин.

Пример 2. Синтез пептида Phe-Pro-Gly-Pro

I. Boc-Pro-Gly.

А) 10,75 г (50 ммоль) Boc-Pro растворяли в 150 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли 7,7 мл (50 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли 6,8 мл (55 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор Gly. Одновременно приготавливали раствор Gly.

Б) Gly 4,5 г (60 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 35 мл воды и 60 мл ацетонитрила, прибавляли 8,4 мл (60 ммоль) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе. К остатку добавляли ˜50 мл воды. Водный раствор подкисляли 3-х кратным избытком NaHSO₄ (24,84 г) до рН 3, экстрагировали 5 раз по 100 мл этилацетатом. Объединенный раствор этилацетата промывали Н₂О (50 мл), 10% раствором KHSO₄ (50 мл), H₂O (50 мл), насыщенным раствором NaCl (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли сухой эфир. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход - 5,97 г (21,74 ммоль); (43,5%)

Rf - 0,863 (2); 0,746) (3); 0,847 (7); 0,903 (8)

Т.пл. 70°С.

II. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1) 5,97 г (21,74 ммоль) Boc-Pro-Gly растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°C, к раствору прибавляли избыток 1,1 (3,35 мл; 23,9 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (2,34 мл; 23,9 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор HCl·Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор HCl·Pro-OBzl.

2) HCl·Pro-OBzl 6,3 г (26,1 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила, прибавляли 4,0 мл (28,71 ммоль; избыток 1,1) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂O (3 раза по 25 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли ˜100 мл сухого эфира. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход - 8,12 г (17,66 ммоль); (81,23%)

Rf - 0,620 (3); 0,326 (7); 0,947 (8); 0,390 (9); 0,716 (10)

Т.пл. 125-126°С.

Элементный анализ: С 62,89 (62,73); N 9,21 (9,14); Н 7,52 (7,237).

III. ТФА·Pro-Gly-Pro-OBzl. К 8,12 г (17,66 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl прибавляли 44,15 мл хлористого метилена и 44,15 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитной группы раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход: 7,95 г (17,3 ммоль); 98%.

Rf - 0,043 (7); 0,247 (8); 0,018 (9)

IV. Boc-Phe-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1) 3,89 г (14,68 ммоль) Boc-Phe растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С к раствору прибавляли избыток 1,1 (2,26 мл; 16,15 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С, перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (1,99 мл; 16,15 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор TOA·Pro-Gly-Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор ТФА·Pro-Gly-Pro-OBzl.

2) ТФА·Pro-Gly-Pro-OBzl. 8,12 г (17,66 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила, прибавляли 4,94 мл (35,32 ммоль; 2-х кратный избыток до рН 8-9) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂О (3 раза по 25 мл), 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 25 мл), Н₂O (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂O (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. Остаток растворяли ˜30 мл сухого эфира и высаждали гексаном. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход - 8,38 г (13,83 ммоль); (94,0%)

Rf - 0,890 (6); 0,540 (7); 0,731; (8)0,373 (9)

Т.пл. 87-88°С.

V. Boc-Phe-Pro-Gly-Pro. 8,38 г (13,83 ммоль) Boc-Phe-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, прибавляли 0,5 мл СН₃СООН и палладиевую чернь, перемешивая на магнитной мешалке пропускали водород в течение 2-х часов. Раствор отфильтровывали, упаривали, два раза упаривали с бензолом, один раз с этилацетатом, добавляли 10 мл этилацетата и заливали гексаном. Выпавший осадок отфильтровывали, промывая на фильтре гексаном. Полученный осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход - 6,37 г (12,72 ммоль); (92%)

Rf - 0,64 (12)

Т.пл. 101-103°С.

VI. Phe-Pro-Glv-Pro. К 6,37 (12,72 ммоль) Boc-Phe-Pro-Gly-Pro-OH прибавляли 19,1 мл 1 н. HCl/СН₃СООН выдерживали 45 минут при комнатной температуре, после снятия защитных групп раствор два раза упаривали с абс. метанолом, два раза с бензолом, заливали гексаном. Гексан сливали, а полученный осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над P₂O₅/KOH и парафином. К высушенному осадку добавляли абс. этилацетат, упаривали на роторном испарителе, добавляли 10 мл абс. этилацетата и высаждали сухим эфиром. При добавлении эфира выпадает осадок, который отфильтровывали. Осадок сушили в эксикаторе под вакуумом над Р₂O₅/КОН и парафином. Белый кристаллический порошок.

Выход - (12,27 ммоль) (96,5%).

Полученный осадок растворяли в 10 мл 30% этанола и наносили на колонку со смолой Амберлист А-21 (AcO^--форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюировали пептид 200 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход - (10,67 ммоль) (87%).

Rf - 0,06 (1); (085) (5); (055) (11); (0,474) (13)

Т.пл. 149-150°С.

Результаты ВЭЖХ: Колонка Supercosil ABZ+Plus размер 4,6×250 мм; скорость потока 1 мл/мин; 20% МеОН, 80% NH₄H₂PO₄+Н₂PO₄ (50 mM, pH 2.8), время выхода 13,36 мин.

Пример 3. Синтез пептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro.

I. Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl получали по методике как описано в примере 1.

Выход - 4,76 г (7,9 ммоль) 85%

Rf - 0,44 (4); 0,8 (5)

Т.пл. 108-110°С

[α]_D ²²=-77,8° (с=0,5; СН₃СООН).

II. TFA-Arg(NO₂)-Pro-Glv-Pro-OBzl. 4,76 г (7,9 ммоль) Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл хлористого метилена, добавляли 20 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход количественный.

Rf - 0,16 (4); 0,27 (5).

III. Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Grv-Pro-OBzl. Boc-Pro 1,7 г (7,9 ммоль) растворяли в 20 мл ТГФ, добавляли 1,07 г (7,9 ммоль) ОБТ, охлаждали до 0°С и добавляли 1,8 г ДЦГК в 50 мл ТГФ. Через 40 мин к реакционной смеси добавляли раствор TFA-H-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl (7,9 ммоль) в 50 мл ТГФ и 1,1 мл (7,9 ммоль) ТЭА. Перемешивали 2 часа при 0°С и 2-е суток при комнатной температуре, затем отфильтровывали ДЦМ, упаривали в вакууме, растворяли в 500 мл ЭА и обрабатывали аналогично Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход 4,07 г (6,5 ммоль) 67,8%

Rf - 0,42 (4); 0,72 (5); 0,31(9)

Т пл. 147-148°С.

IV. TFA-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Glv-Pro-OBzl. Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl 4,07 г (5,3 ммоль) растворяли в 14 мл хлористого метилена, добавляли 14 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход - 3,94 г (5,2 ммоль) 97%

Rf - 0,095 (4); 0,246(2); 0,202(10)

V. Boc-Lvs(Z)-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

А) К Boc-Lys(Z)-OH 3,8 г (10 ммоль) в 25 мл абс. ЭА добавляли 2,26 г ДЦГК и 1,87 г пентафторфенола в 50 мл ТГФ, охлаждали до 0°С. Реакционную смесь перемешивали 2 часа при 0°С, отфильтровывали ДЦМ, раствор упаривали в вакууме, добавляли 25 мл абс. эфира и 75 мл гексана, постепенно при охлаждении отделялся осадок, который отфильтровывали и высушивали в вакууме.

Выход - 2,8 г (87%)

Rf - 0,84 (4); 0,91 (9)

Т.пл. 117-120°С.

Б) К TFA-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl 2,27 г (5,2 ммоль), растворенного в 50 мл ТГФ и охлажденного до 0°С, прибавляли при перемешивании 0,75 мл ТЭА и затем в течение 2 часов четырьмя порциями Boc-Lys(Z)-OPfp 2,8 г (5,2 ммоль).

Перемешивали 24 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали в вакууме, остаток растворяли в 300 мл ЭА и обрабатывали, аналогично Вос-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход - 3 г (3 ммоль) 58%

Rf - 0,38 (4); 0,75 (5)

Т.пл. 130-132°С

[a]_D ²²=-86,2° (с=0,5; СН₃СООН).

VI. Вос-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OBzl. 3 г (3 ммоль) Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, добавляли 0,5 мл 1 н соляной кислоты и 3 г катализатора - 10% окись палладия на нейтральной окиси алюминия, гидрировали в токе сухого водорода при комнатной температуре и давлении 1 атм в течение 6 часов. Затем катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Объединенный фильтрат упаривали досуха. Остаток высаждали из абс. метанола сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в вакууме.

Выход - 2,67 г (2,67 ммоль) 89%.

VII. Lvs-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 2,67 г (2,67 ммоль) Boc-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OBzl суспензировали в 5 мл 2 н соляной кислоты в диоксане и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляли сухой эфир, выпавший осадок промывали декантацией сухим эфиром. Переосаждали из абсолютного метанола эфиром. Полученный осадок растворяли в 5 мл 30% этанола и наносили на колонку с Амберлистом А-21 (АсО^--форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюировали пептид 100 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход - 1,54 г (2 ммоль) 75%

Rf - 0,24(6)

Т.пл.=151°С

[α]_D ²²=-65,0° (с=0,5; СН₃СООН).

Результаты ВЭЖХ: Колонка Zorbax ODS d=4,6 mm; t=35°C скорость потока 1 мл/мин; A=50 mM NH₄Н₂PO₄ (рН 2,5); В=А+МеОН (1:1); 10-60% В (за 25 мин). Время выхода 16,5 мин.

Пример 4. Синтез пептида HCl Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro.

I. Z-Glu(OBu^t)-His-OMe. В колбе №1 13,5 г (40 ммоль) Z-Glu(OBu^t)-OH растворяли в 50 мл хлористого метилена, охлаждали до +5°С и добавляли 5,6 мл (40 ммоль) ТЭА. Реакционный раствор охлаждали до -25°÷-30°С. При этой температуре прибавляли из пипетки 5,30 мл (40 ммоль) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Температуру реакции удерживали в интервале -18÷-20°С в течение 20 мин. Одновременно в колбе №2 готовили раствор 12,1 г (50 ммоль) 2HCl·H-His-OMe в 70 мл хлороформа, содержащего 14 мл (100 ммоль) ТЭА, и для полного растворения нагревали до 60°С. Раствор охлаждали до -25°С, и после образования смешанного ангидрида глутаминовой кислоты в колбе №1 ее содержимое приливали сразу к раствору эфира в колбе №2. Температура реакционной смеси повышается до -10°С, эту температуру поддерживали 1 час, затем раствор оставляли на 1 час в холодильнике и выдерживали при 20°С еще в течение 3-х часов. Реакционный раствор упаривали, добавляли 300 мл этилацетата, полученный раствор промывали 3 раза по 30 мл Н₂O, 3 раза по 30 мл 10% Na₂CO₃, 3 раза по 30 мл Н₂О, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. При упаривании выпадает осадок, который отфильтровывали, промывали на фильтре гексаном, сушили в вакууме. Остаток растирали с гексаном, отфильтровывали, сушили.

Выход - 18,36 г (94%)

Rf - 0,213(1); 0,64(2); 0,495(3); 0,428(6)

Т.пл. 98-100°С [c=1; СН₃ОН).

II. Z-Glu(OBu^t)-His-N₂H₃. 18 г (37 ммоль) Z-Glu(OBu^t)-His-OMe растворяли в 25 мл метанола и добавляли 6,9 мл (138 ммоль) гидразин-гидрата, перемешивали на мешалке при 20°С 72 часа. Реакционную смесь упаривали. Кристаллизовали из 50% метанола, выпавший осадок промывали на фильтре небольшим количеством воды и эфиром, сушили в вакууме над Р₂O₅/КОН.

Выход - 13,7 г (76%)

Rf - 0,484 (2); 0,206 (3); 0,94 (5); 0,114 (6)

Т.пл. 145-147°С

[α]_D ²²=-32,8° (с=1; СН₃ОН).

III. Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-OMe. К охлажденному до -20°С раствору 8,8 г (18 ммоль) Z-Glu(OBu^t)-His-N₂H₃ в 50 мл ДМФА добавляли 15,5 мл (4 экв.) раствора хлористого водорода в этилацетате, 2,14 мл (18 ммоль) трет-бутилнитрита и перемешивали 30 мин при -5°С. Реакционную смесь охлаждали до -40°С и прибавляли охлажденный до -10°С раствор 4,34 г (18,9 ммоль) гидрохлорида метилового эфира фенилаланина в 30 мл ДМФА и 2,6 (18,9 ммоль) ТЭА. Выдерживали 72 часа при 4°С. Упаривали, добавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали Н₂O, 5% NaHCO₃, H₂O, 0,5% NH₄OH, Н₂О, насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток растирали с гексаном.

Выход - 11,35 г (97%)

Rf - 0,356 (1); 0,68 (2); 0,245 (3)

Т.пл. 85-90°С

[α]_D ²²=-31,30 (c=1; СН₃ОН).

IV. Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-N₂H₃ получали из Z-Gl(OBu^t)-His-Phe-OMe аналогично синтезу соединения Z-Glu(OBu^t)-His-N₂Н₃.

Выход - 86%:

Rf - 0,25 (1); 0,582 (2); 0,204 (3)

Т.пл. выше 200°С

[α]_D ²²=-31,3°^{(c=1; СН₃ОН).}

V. Boc-Pro-Gly-OEt. Boc-Pro 8,3 г (38,45 ммоль) растворяли в 50 мл CH₂Cl₂, охлаждали до +5°С, добавляли 38,45 ммоль (5,38 мл) ТЭА. Реакционную смесь охлаждали до -25÷-30°С. При этой температуре из пипетки прибавляли 38,45 ммоль (4,84 мл) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Температуру реакционной смеси удерживали в интервале -18÷-20°С 20 минут. Одновременно готовили раствор 5,9 г (42,3 ммоль) избыток 1,1 HCl·Н-Gly-OEt в 75 мл хлороформа, содержащего 5,92 мл ТЭА. Раствор охлаждали до -25°С и, после образования смешенного ангидрида в первой колбе, ее содержимое приливали сразу же к раствору эфира. Реакционную смесь выдерживали при температуре -10°С 1 час и затем при температуре +4°С 12 часов при перемешивании на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, добавляли 250 мл этилацетата, раствор этилацетата промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н HCl, 3 раза по 25 мл Н₂O, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток высушивали в вакууме над Р₂О₅/КОН и парафином.

Выход - 10,2 г (30,3 ммоль), 78,83%

Rf - 0,5 (7); 0,862 (8); 0,719 (10).

VI. Boc-Pro-Gly-N₂H₃. Boc-Pro-Gly-OEt 10,2 г (30,3 ммоль) растворяли в 80 мл абсолютного метанола, добавляли 4-х кратный избыток гидразин-гидрата 5,88 мл (121,2 ммоль). Перемешивали 12 часов на магнитной мешалке при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, два раза упаривали с эфиром, остаток заливали эфиром (5 мл) и оставляли в холодильнике на ночь (для лучшей кристаллизации добавляли затравку). Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили в эксикаторе.

Выход - 6,9 г (20,79 ммоль), 68,62%

Rf - 0,284 (7); 0,474 (8); 0,189 (9); 0,427 (10)

Т.пл. 98-100°С.

VII. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl. К охлажденному до -20°С раствору Boc-Pro-Gly-N₂H₃ 4,7 г (14,6 ммоль) в 40 мл диметилформамида добавляли 58,4 ммоль (4-х кратный избыток) раствора хлористого водорода в этилацетате и сразу же 1,73 мл (14,6 ммоль) трет-бутилнитрита, реакционную смесь перемешивали 30 минут при -5°С. Реакционную смесь охлаждали до -40°С и добавляли охлажденный до -10°С раствор 8,2 мл (58,4 ммоль) ТЭА в 4 мл ДМФА; когда температура реакционной смеси повышалась до -20°С добавляли 3,7 г (15,3 ммоль) избыток 1,05 HCl·Н-Pro-OBzl в 20 мл ДМФА и 2,14 мл ТЭА. Выдерживали при 4°С 24 часа, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в 200 мл этилацетата и промывали 2 раза по 20 мл H₂O, 3 раза по 20 мл 10% KHSO₄, 3 раза по 20 мл H₂O, 3 раза по 20 мл 5% NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О. Этилацетатный слой высушивали над MgSO₄. Упаривали, остаток заливали небольшим количеством эфира (10 мл). Оставляли в холодильнике. Для лучшей кристаллизации продукта добавляли затравку. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре небольшим количеством эфира. Сушили в эксикаторе.

Выход - 5,358 г (11,65 ммоль), 79,92%

Rf - 0,326 (7); 0,390 (9); 0,947 (8); 0,716 (10)

Т.пл. 125-126°С

[α]_D ²²=-101,2° (c=0,85; СН₃ОН).

VIII. ТФА·Н-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5,358 г (11,65 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 29,13 мл хлористого метилена, добавляли 29,13 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход - 4,63 г (9,7 ммоль), 98%

Rf - 0,043 (7); 0,247 (8); 0,018 (9).

IX. Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OBzl получали из соединений Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-N₂H₃ и TFA-H-Pro-Gly-Pro-OBzl аналогично синтезу Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-OMe.

Выход - 88%

Rf - 0,196(1); 0,605(3); 0,956(4)

Т.пл. 40°С (разл.)

[α]_D ²²=-84,8° (c=1; СН₃ОН).

X. H-Glu(OBu^t)-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OH. 12,28 г (12,8 ммоль) соединения Z-Glu(OBu^t)-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл смеси метанол-уксусная кислота-вода (6:1:1) и гидрировали над Pd-чернью 24 часа.

Pd-чернь отфильтровывали, раствор упаривали два раза с бензолом, два раза с абс. метанолом. Высаждали из абс. метанола этилацетатом.

Выход - 9,8 г (90%)

Rf - 0,340(4); 0,252(5)

Т.пл. 95-98°С (разд.)

[α]_D ²²=-59,1° (c=1; CH₃OH).

XI. HCl·H-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro. Растворяли 12.28 г (12.8 ммоль) Н-Glo(OBu^t)-His-Phe-Pro-Gly-Pro-ОН в 19,2 мл 1 н HCl/СН₃СООН. выдерживали 45 минут при 20°С. Реакционную смесь высаждали из абс. эфиром, полученный осадок переосаждали из абс. метанола этилацетатом. Пептид отфильтровывали и сушили в вакууме над КОН, Р₂О₅ и парафином.

Выход - 11,7 г (95%)

Rf - 0,257(5)

Т.пл. 120°С (разл.).

Результаты ВЭЖХ: Колонка Supercosil ABZ+Plus размер 4,64250 мм: скорость потока 1 мл/мин: 20% МеОН, 80% NH₄H₂PO₄+H₃PO₄ (50 mM, рН 2,8), время выхода 7,98 мин.

Пример 5.

Готовят растворы пептидов: 1 мг пептида растворяют в 2,5 мл физиологического раствора. При нанесении на пластины нестабилизированного фибрина по 0,03 мл растворов пептидов установлено наличие фибринолитической активности неферментативной природы. Зоны лизиса составляли 25-36 мм², в то время как в контрольных пробах (с NaCl без пептидов) зоны лизиса не обнаруживались. При добавлении 0,1 мл раствора пептидов к 0,2 мл плазмы крови здоровых крыс выявлено наличие у пептидов антикоагулянтной активности (по тесту АЧТВ время образования фибринового сгустка удлинялось в 1,3-1,4 раза по сравнению с контрольным раствором NaCl). Далее препараты пептидов вводят внутривенно в v.jugularis 5-ти лабораторным белым крысам по 0,5 мл (200 мкг) на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl, в объеме 0,5 мл на 200 г массы тела. Через 10 мин берут кровь и центрифугируют ее при 1000 об/мин в течение 5 мин для получения богатой тромбоцитами плазмы (для анализа агрегации тромбоцитов), затем дополнительно центрифугируют кровь в течение 10 мин при 2000 об/мин и получают плазму, бедную тромбоцитами.

В богатой тромбоцитами плазме агрегация тромбоцитов в опытных пробах составляла 65%, в то время как в контроле - 100%, т.е. препараты пептидов обладают антитромбоцитарной активностью при введении в кровоток.

Пример 6.

Берут препараты пептидов по 1 мг, растворяют каждый в 2,5 мл физиологического раствора и вводят внутривенно белым крысам в v.jugularis в дозе 200 мкг/ 200 г массы тела. Далее поступают так, как описано в примере 5. В бедной тромбоцитами плазме обнаружено увеличение активности активатора плазминогена в 2,1 раза, общей фибринолитической активности - в 1,6 раза, антикоагулянтной активности - в 1,5 раза, неферментативной фибринолитической активности - в 1,7 раза по сравнению с контролем (физиологическим раствором). Следовательно, пептиды обладают антикоагулянтно- фибринолитической активностью при введении в кровоток.

Пример 7.

Берут препараты пептидов по 1 мг, растворяют каждый в 2,5 мл физиологического раствора и вводят интраназально в течение 5 дней через каждые 24 часа 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl. Через 5 дней после последнего введения в изолированном зажимами участке v.jugularis (стаз) с помощью тромбина путем его внутривенного введения в дозе 0,5 мг/0,5 мл вызывают образование тромба и определяют через 1 час вес образовавшихся тромбов и измеряют в мг. Показано, что у животных, предварительно получавших пептиды, тромбы или не образовывались, или их вес был небольшим - менее 0,4 мг, в то время как у контрольных животных вес тромбов составлял выше 1,7 мг. Следовательно, пептиды обладают антитромботической активностью, предупреждая процессы тромбообразования в кровотоке.

Таким образом, все исследованные пептиды обладают антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью, что продемонстрировано в сводной таблице 1.

Таблица 1.АктивностиИзвестные пептиды-продукты расщепления фибриногена [4]Предлагаемые пептиды1) антикоагулянтная in vitro и in vivoОтсутствуетимеется2) ферментативная фибринолитическая активность (общая) в кровотокеЛокальнаяимеется3) фибринолитическая активность неферментативной природыОтсутствуетимеется4) антитромбоцитарная в кровотокеимеетсяимеется5) антитромботическаяимеетсяимеется6) фибринолитическая активность, обусловленная появлением в крови активатора плазминогенаОтсутствуетимеется

Следовательно, заявленные пептиды, обладающие антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной, антитромботической активностью, имеют преимущества перед известными пептидами, продуктами расщепления фибриногена, применение которых в клинике не описано и которые обладают только антитромботической и антитромбоцитарной активностью в крови.

В таблице 2 представлены данные, свидетельствующие о преимуществе заявленных пептидов общей формулы Х-Pro-Gly-Pro, где Х=Phe-; Arg-; Lys-Pro-Arg-; Glu-His-Phe- no сравнению с эталонными препаратами комплекса гепарин-фибриноген и три- и тетрапептидами (Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly).

Таблица 2.АктивностиPhe-Pro-Gly-ProArg-Pro-Gly-ProLys-Pro-Arg-Pro-Gly-ProGlu-His-Phe-Pro-Gle-ProКомплекс фибриноген-гепарина (прототип)Pro-Gly-Pro (прототип)Gly-Pro-Gly (прототип)In vitro Антикоагулянтная122%145-160%130-160%122%140%122-140%118%Фибринолитическая (суммарная)42 мм²32-56 мм²30-36 м²20 мм²30-36 мм²36-42 мм²24 мм²Антитромбоцитарная60.5-77%40-60%70%91%-83%75%In vivo Внутривенное введение. Антикоагулянтная активность144%125%120%115%135%173%100%Фибринолитическая неферментативная активность170%170%97%155%140%173%100%Активность тканевого активатора плазминогена190%190%75%310%103%220%100%Агрегация тромбоцитов81%83%108%102%-83%100%Интраназальное введение       Антитромботическая активность (по весу тромбов)24%24%24%24%48%19%100%

Таким образом, из таблицы 2 видно, что заявленные пептиды имеют преимущество перед эталонными препаратами комплекса фибриноген-гепарин и пептидами Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly по степени увеличения антикоагулянтно-фибринолитической активности и снижения агрегации тромбоцитов в условиях in vitro; при внутривенном введении антикоагулянтно-фибринолитические эффекты заявленных пептидов превышают те же активности эталонного тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly; при интраназальном введении антитромботические эффекты заявленных пептидов превышают подобное действие комплекса фибриноген-гепарин и тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается антитромбического, антикоагулянтного, фибриндеполимеризационного и фибринолитического средства, содержащего новые пептиды общей формулы: X-Pro-Gly-Pro, где X=Phe-, Arg-, Lys-Pro-Arg-, Glu-His-Phe-. Заявленное средство обладает высокой активностью и эффективностью по сравнению с известными средствами. 2 табл.

Пептиды общей формулы:

X-Pro-Gly-Pro, где

X=Phe-,

Arg-,

Lys-Pro-Arg-,

Glu-His-Phe-;

обладающие антикоагулянтно-фибринолитической, антитромбоцитарной и антитромботической активностью.