Способ получения производных хлоргидрата гептапептида Советский патент 1987 года по МПК C07K7/06 A23K1/16 

Изобретение отно.сится к способу получения производных хлоргидрата гексапептида - новых биологически активных соединенш, которые могут . найти применение в ветеринарии.

Целью изобретения являются новые производные гексапептидов, малотоксичные, обладающие высокой способностью промотировать рост животных.

Значения R, определяют с помощью предварительно обработанных пластин силикагеля 60 (Мегск) толщиной слоя 0,25 мм, длиной 20 см, используя следующие проявляющие системы. Система А. Бензол/бензин (60-80)

этилацетат 70(10)40 по объему.

Система В. Бензол/этилацетат (уксусная кислота ) вода

100(100/20)10 по объему (верхняя фаза;.

Система С. Бензол/зтилацетат (уксусная кислота ) вода 100(100/40)15 по объему (верхняя фаза ).

Система С. н-бутанол (уксусная кислота ) вода 4(1)1 по объему

Е.Магск - торговая марка.

Анализы тонкослойной жидкостной хроматографии осуществляют в интервале температур 8-25°С, при этом значения R, могли изменяться на ±5%. Температуры плавления определяют в открытых капиллярах в-аппарате Тото- ли и поправку не вносят. Большинство производных размягчается и разлагается перед плавлением. Растворители для кристаллизации, осаждения или измельчения указаны в скобках.

Высоковольтный бумажный электрофорез проводят на приборе Pherograph Original-Frankfurt тип 64 на бумаге Schleicher and Schull № 2317 при рН 1,2 (муравьиная кислота:уксусная кислота:вода 123:100:777 по объему), при 1600v/40v (см) при рН 5,8 (пиридин:уксусная кислота:вода 450:50:45000 по объему ) при 1400v/ /32,5v (см). Полученные продукты характеризуют по их подвижностям по отношению к G1U при рН 1,2 (Е j и рН 5,8 (Es,8 ).

В примерах использованы следующие символы и сокращения: АсОЕ этилацетат; вое трет-бутоксикарбонил; Bzl бензил, - разложение; ДМФ диме- тилформамид; ЕЦО дизтиловый эфир; НС1 (ТГФ хлористый водород в тетрагидрофуране), i диизопропило- вый эфир; i РгОН изопропанол; Me метил; МеОН метанол; NMM N-метил-мор- , фолин; РЕ петролейньш эфир; ТГФ тет- рагидрофуран; TLC тонкослойная хроматография .

Пример 1. Получение H-Val- Pro-Pro-Leu-Gly-Trp-Met-OH, HCl

0 (XIII ТК-7). Стадия 1. BOC-Trp-Met- ОМе (I).

К раствору 30,43 г (100 ммоль) ВОС-Тгр-ОН в 200 мл безводного ТГФ последовательно добавляют 11,2 мл

5 (100 ммоль) NMM и 9,9 мл этилхлор- формата при -12 С. После перемешивания при этой температуре в течение 2 мин добавляют холодный раствор 19,96 г (100 ммоль) HCl-H-Met-OMe и

0 11,2 мл NMM (100 ммоль) в 150 мл ДМФ. Реакционную смесь перемешивают в течение 45 мин при и 90 мин при 0-15 С, а затем фильтруют от солей и выпаривают в вакууме. Остаток

5 растворяют в зтилацетате и промьюают несколько раз последовательно хлористым натрием насыщенными растворами 1М лимонной кислоты, 1М бикарбоната натрия и водой. Органический слой

0 сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляют в вакууме. Получают 39,12 г (выход 87%) соединения I из изо-РгОН (изо-Рг О)РЕ:т.

пл. 95-97 С.

(

-25,1°(с

1, МеОН). R 0,73; К.0,76. Стадия 2. НС1H-Trp-Met-OMe (Ц).

39,00 г С86,75 ммоль) ВОС-Тгр- Met- ОМе (I) растворяют в 390 мл муравьиной кислоты при комнатной температуре. После завершения удаления ВОС (контролируемого TLC) растворитель выпаривают в вакууме при 30 С. Остаток растворяют в метаноле, охлажденном до , и добавляют 34,7 мл (104,1 ммоль) ЗМ раствора НС1/ТГФ. Растворители удаляют в вакууме и получают 33,48 г в количественном выходе соединения II в виде масла, Rfj, 0,71; EI.-I 0,82. Стадия 3. BOC-Gly-Trp-Met-OMe (III).

Исходя из 15,20 г (86,75 ммоль) ВОС-С1у-ОН и 33,48 г (86,75 ммоль) gg HCl-H-Trp-Met-OMe (II) по способу стадии I используя хлороформ вместо этилацетата при выделении продукта, получают 26,37 г (выход 60%) соединения III из ACOEt ( ) изо-Рг 0:

.( X

:т.пл. 140-145°С.

X (с , МеОН). R.g 0,56; R 0,77;

R- 0,27.

Стадия 4. HCl-H-Gly-Trp-Met-OMe (Ж)

Исходя из 26,20 г (51,71 ммоль) BOC-Gly-Trp-Met-OMe (1П) и по способу описанному на стадии 2, получают 21,76 г (выход 95%) соединения из изо-РгОН/изо-Рг2.0:т.пл.

195°С

(с разложением), ( oi -12,9° (с

1, МеОН), F 0,49; Е,. 0,84. Стадия 5. BOC-Leu-Gly-Trp-Met-OMe (V).

К раствору 12,16 г (48,76 ммоль) BOC-Leu-OH в 120 мл безводного ТГФ последовательно добавляют 5,5 мл (48,76 моль) NMM и 4,8 мл (48,76 ммоль) этилхлорформата при -12°С. После перемешивания в течение 2 мин при этой температуре добавляют охлажденный раствор 21,6 г (48,76 ммоль) HCl-H-Gly-Trp-Met-OMe (W ) и 5,5 МП (48,76 ммоль ) NMM в 100 мл ДМФ. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при -12 С и в течение 2 ч при 0-15°С, а затем отфильтровывают от солей и выпаривают в вакууме. Сырой продукт очищают на хроматографической колонке на сили- кагеле (Мегск.) 0,040-0,063 мм, элюи- руя АсОЕ. Соединение V получают из AcOKt ()PE 18,13 г (выход 60%):

-31,6 (с

:т.пл. НОС. ( об) 1, МеОН). R 0,14; RiB 0,54. Стадия 6. HCl-H-Leu-Gly-Trp-Met-OMe (VI).

18 г (29,04 ммоль) BOC-Leu-Gly- Trp-Met-OMe (V) растворяют в 290 мл насыщенного раствора хлористого водорода в ледяной уксусной кислоте, к которой добавлено 18 мл анизола и 9 МП. 2-меркаптоэтанола. Спустя 30 мин при комнатной температуре удаление вое завершается и растворитель удаляют в вакууме при 30°С. Сырой продукт очищают на хроматографической колонке на силикагеле (Merck) 0,040-0,063 мм, элюируя смесью хлороформ: метанол 8:2. Из изо-РгОН/изо- получают 12,44 г (выход 77%) соединения VI : т. пл. 170°С. ( -9,9°(с E,,i 0,71. Стадия 7. BOC-Pro-Pro-OBzl (VII).

К раствору 21,52 г (100 ммоль) ВОС-Рго-ОН в 200 мл безводного ТГФ

25 уксусной кислоте при ко ратуре. Спустя 30 мин у завершается и растворит в вакууме. Из изо-РгОН ют 21,60 г (выход 75%) vm: , 0,32; Е ,., 1, Стадия 9. BOC-Val-Pro-P Исходя из 13,79 г (6 BOC-Val-OH и 21,5 г (6 HCl H-Pro-Pro-OBzl (vni) стадии 7 получают 22,28 соединения IX в виде ма очистки на хроматографи с силикагелем (Merck) 0 элюируя смесью этилацет 98:2.

Стадия 10. BOC-Val-Pro22,28 г (44,42 ммол Pro-Pro-OBzl (IX) раств метанола и гидрируют п

45 температуре и атмосфер присутствии 4,46 .г (10 палладия на угле. Ката фильтрованием, а раств ют в вакууме. Остаток

50 этилацетате и концентр После разбавления диэт получают 10,98 г (выхо 184-199°

35

40

нения X т.пл.

-149,9° (с 1, МеО

1, МеОН) ,62; 55 « Е . 0,51,

Стадия 11. BOC-Yal-Pro Trp-Met-OMe (XI),

Исходя из 9,10 г (2 BOC-Val-Pro-Pro-OH и 1

последовательно добавляют 11,2 мл NMM и 13,3 мл изобутилхлорформата при -10 С. После перемешивания в течение 3 мин при этой температуре добавляют холодный раствор 24,17 г (100 ммоль). HCl-H-Pro-OBzl и 11,2 мл (100 ммоль) NMM в 150 мл ДМФ, Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при -10 С и в течение 2 ч при 0-15°С, а затем

0

фильтруют от солей и выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в этилаце- тате и несколько раз промывают насы- щенньми растворами хлористого натрия

5 1М лимонной кислоты, 1М бикарбоната натрия и воды. Органический слой сушат над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляют в вакууме, после чего получают 34,21 г (выход 85%)

Q соединения VII в виде масла R. 0,62. .Стадия 8. HCl.H-Pro-Pro-OBzl (VIII)/

34,21 г (85 ммоль) ВОС-Рго-Рго- OBzl (Vli) растворяют в 342 мл насыщенного раствора хлористого водорода в

5 уксусной кислоте при комнатной температуре. Спустя 30 мин удаление БОС завершается и растворитель удаляют . в вакууме. Из изо-РгОН/АсОЕ1 получают 21,60 г (выход 75%) соединения vm: , 0,32; Е ,., 1,12. Стадия 9. BOC-Val-Pro-Pro-OBzl (|Х). Исходя из 13,79 г (63,45 ммоль) BOC-Val-OH и 21,5 г (63,45 ммоль) HCl H-Pro-Pro-OBzl (vni) и по способу стадии 7 получают 22,28 г (выход 70%) соединения IX в виде масла после очистки на хроматографической колонке с силикагелем (Merck) 0,040-0,063 мм, элюируя смесью этилацетат:метанол 98:2.

Стадия 10. BOC-Val-ProPro-OH (X). 22,28 г (44,42 ммоль ) BOC-Val- Pro-Pro-OBzl (IX) растворяют в 150 мл метанола и гидрируют при комнатной

5 температуре и атмосферном давлении в присутствии 4,46 .г (10%) по весу палладия на угле. Катализатор удаляют фильтрованием, а раствор концентрируют в вакууме. Остаток растворяют и

0 этилацетате и концентрируют в вакууме. После разбавления диэтиловым эфиром получают 10,98 г (выход 60%) соеди- 184-199°С. (огГ

5

0

, го

нения X т.пл.

-149,9° (с 1, МеОН), Н 0,24;

5 « Е . 0,51,

« Е . 0,51,

Стадия 11. BOC-Yal-Pro-Pro-Leu-Gly- Trp-Met-OMe (XI),

Исходя из 9,10 г (22,12 ммоль) BOC-Val-Pro-Pro-OH и 12,30 г

513

(22,12 ммоль) HCl-H-Leu-Gly-Trp -Met

ОМе (YI ) и по способу стадии 5, однако используя в качестве элюента этилацетат, содержащий возрастающие количества метанола от 5 до 30% в процессе хроматографической очистки, получают 16,16 г (выход 80%) соединения ХГ из изо-РгОН/изо-Рг О: : т.пл. 184-190°С. ( -98,9 (с 1, МеОН) ,13; Е 0,58. Стадия 12. BOC-Val-Pro-Pro-Leu-Gly-. Trp-Met-OH (XII ).

5,00 г (5,48 ммоль) BOC-Val-Pro- Pro-Leu-Gly-Trp-Met-OMe (Xl) растворя- ют в 20 мл метанола и омыляют 10 мл 1М гидроокиси натрия в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор разбавляют водой, частично концентрируют в вакууме, охлаждают до 0°С, подкисляют до рН 25 М водной соляной кислотой, а затем несколько раз экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают до нейтрального насыщенным водным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. После удаления растворителя получают 3,99 г (выход 81%) соединения XII : т.пл. 194-200°С.

(Г° -102,9°С (с 1, МеОН) R, 0,34; Ej,8 0,18 Glu.

Е

1,2

0,58 Glu.

Отадия 13. H-Yal-Pro-Pro-Leu-Gly- Trp-Met-OH-HCl (Xill).

Исходя из 3,85 г (4,28 ммоль) BOG-Val-Pro-Pro-Leu-Gly-Trp-Met-OH (хи) и по способу стадии 6 получают 3,05 г сырого соединения XIII из изо- РгОН/изо-Рг О. Затем этот продукт очищают на ДЕАЕ -Scphadex А-25 (торговая марка), используя в качестве элюента 0,02 М раствор ацетата аммония при рН 6,7. После лиофилизации из уксусной кислоты продукт вновь растворяют в уксусной кислоте и обрабатывают 6 мл насыщенного раствора соляной кислоты в уксусной кислоте. Раствор вьшивают в диэтиловый эфир. Получают 2,57 г (выход 72%) соединения ХШ : т.пл. 150 С. (о)л° -90,5° (с 1 , МеОН); R 0,30;

НПример 2. Получение НС Val-Pro-Pro-4 eu-Gly-Trp-Met-OMe (XIV)TK7. Исходя из 5,00 г (4,28 ммоль) BOC-Yal-Pro-Pro-Leu-Gly- Trp-Met-OMe (Xl), полученного в примере 1, стадия 11, и по способу примера 1 стадии 6 однако, используя

0

5

0

.,

в качестве элюента систему :МеОН:Н,,0 86; 14:1 во время хроматографической очистки, получают 2,73 г (выход 75%) соединения XIV из AcOEt: т.пл. 154°С; (ct) - -92, (с 1, МеОН) 0,34; Е ,,г 0.58 Glu.

Пример 3. Получение НС1 Н- Val-Pro-Pro-Leu-Gly-Trp-Mel-NH i XV).

5,00 г (4,28 ммоль) BOC-Val-Pro- Pro-Leu-Gly-Trp-Met-OMe (XI ), полученного в примере 1 на стадии 11, растворяют в растворе 100 мл метанола и 2 мл этиленгликоля, и насыщают аммиаком при О С. Реакционную смесь вьщерживают в холодильнике в течение 3 дней, а затем избыток аммиака и растворитель удаляют в вакууме. Неочищенный продукт частично очищают на хроматографической колонке с сили- кагелем (Мегск) 0,040-0,063 мм, элюируя смесью АсОЕ:МеОН 87:13 и используя на следующей стадии без 5 очистки (получают 2,58 г соединения IX и изо-РгОН/изо-Рг,,0):Е,. 0,.31. Стадия 2. H-Val-Pro-Pro-Leu-Gly-Trp- Met-NH, HCl (XVI).

30 Исходя из 2,45 г (2,73 ммоль) вое-V al-Pro-Pro-Leu-Gly-Trp-Met-NH (XV) и по способу .примера 1 стадии 6, однако, используя в качестве элюен- тов системы :Ме-ОН:Н2.0 85:

gg :15:1 по объему и , :МеОН:Н О - 80:20:1 по объему при хроматографической очистке, получают 1,55 г (выход 68%) соединения XVI из МеОН (изо-РгОН)изо-Рг20 после удаления

40 солей на Sephadex G10 (торговая марка): т.пл. 150-158 G. (о)

1 it о

т.пл. -74,8° (с 1, МеОН) R. 0,36;

Е.г

кие

50

- 0,55 Glu. Проведены биологичес- испытания описываемых гептапепти- 4g дов. Описываемые гептапептиды демонстрируют интересную активность промо- тирования роста животныхj определенную в тестовых системах in vivo - in vitro по синтезу протеина тканью печени и по зависящим от дозы привесу и эффективности корма после подкожного и орального введения.

Тест по синтезу протеина in vivo - in vitro.

Тест по росту проводили в течение 4 недель, используя группы по 6 самцов крыс (Wistar, Hagemann, Exter- tal), разделенные на подгруппы по 3 животных, которых содержали в клет55

71

ках Макролона с древесными опилками в качестве подстилки. Вода и корм (стандартный рацион Altromin 1321, содержащий 19% неочищенного протеина) ;a(i Libitim.

Пептиды общей формулы вводили в растворе подкожно ежедневно в дозах 10,50 и 100 нг/кг, используя в качестве разбавителя нормальный физиоло- гический раствор (исходя из начального раствора 100 нг/мл).

Получение образцов тканей. Гомогенизируют 3 г печени в 9 мл буферного сахарозного раствора ТКМ, охлажденно го на льду в гомогенизаторе Поттера со скоростью 600 об/мин в течение 2 мин, центрифугируют при 4- С в ультрацентрифуге при 1OOOOg в течение 20 мин, дека11тируют надосадочную жидкость сок микросомных клеток.

Рабочая процедура. После подсчета содержания протеина в соке микросомных клеток с помощью биуретического метода, концентрацию протеина доводя с помош;ью ТКМ буфера до 1 мг/мл. После этого проводят разбавление би- дистиллированной водой до 0,25 мг протеина на мл сока микросомных клеток .

Добавляют последовательные порции 0,15 мл реакционной среды и 0,05 мл (50 мкг) раствора пируваткиназы, а также 0,1 мл С смеси аминокислот ( I мк Кюри).. Получают объемы по 1 мл инкубируемой смеси.

После инкубирования в течение 35 мин при 37°С в водяной бане получают осаждение протеина за счет добавления 2 мл трихлоруксусной кисло- ты (10%). Осадок промывают, добавляя несколько раз трихлоруксусную кислоту, затем центрифугируют (3600 г/мин до тех -пор, пока в надосадочной жидкости не остается следов радиоактив- ности.

Остаток растворяют в 1,0 мл Ьгяпа- solve и оставляют в течение ночи при 37 С до тех пор, пока он не становится прозрачным. Изменения проводят на PRIAS жидкостном сцинтилляционном счетчике PL (1,0 + 5 мл сцинтилляци- онной жидкости).

Результаты измерений скорости синтеза белка в тканях печени мужски особей крыс после обработки в течение 4 недель и данные по токсичности (ежедневные подкожные инъекции) приведены в табл.1.

4

Контрольная группа. У тех крыс,которым подкожно вводили физиологический солевой раствор по сравнению с необработанной контрольной группой, наблюдалось снижение активности синтеза протеина порядка 13,6%. Предлагаемые гептапептиды значительно ускоряют скорость синтеза белка в печени рыс. При введении их крысам в дозе 10 нг/кг скорость синтеза белка 29,4 и 36,1%, в то время как известое соединение ускоряет синтез белка на 17,3%.

Тест по росту свиней. Тест по привесу проводили в течение 4 недель, спользуя группы из 7 кастрированных самцов свиней (Грибриды), разделенных на подгруппы и содержащиеся в загонах с плоскими настилами. Свиньям в течение всего эксперимента давали корм в количестве 1 кг в день (Hoveler, нормального типа, без добавок), воду в неограниченном количестве. Привес учитывали ежедневно. Результаты эксперимента приведены в табл.2.

Ежедневные инъекции физиологического солевого раствора вызывают сниение привеса по сравнению с необработанными животными. Несмотря на такое снижение привеса, вызванное стрессом при инъекциях, те животные которым ежедневно вводили ТК-7, дали отчетливый привес. Эффективность усвоения пищи отражает результаты привеса. ормула изобретения

Способ получения производных хлор- гидрата гептапептида формулы

H-Val-Pro-Pro.-I.eii-Gly-Trp-Met-Y- НС1,

где Y - ОН, ОСН,, отличающийся тем, что трипептид формулы

Boc-Val-Pro-Pro ОН, активированный этилхлорформиатом, вводят во взаимодействие с метиловым эфиром хлоргидрата тетрапептида формулы

Leu-Gly-Trp-Met ОСИ jНС1

в тетрагидрофуране в присутствии N- метилморфолина при в течение

1ч, а затем при в течение

2ч и полученный продукт формулы

. -.

Boc-Val-Pro-Pro-Leu-Gly-Trp- -Met OCHj

91342424 °

в случае необходимости омыляют обра- кой хлористым водородом в при- боткой едким натром в метаноле и да- сутствин анизола и 2 - меркап- блокируют защищенньш пептид обработ- тоэтанола.

Таблица 1

10

50

100

10

50

100

10 50

100

ая

11958

10336

Начальный вес, кг

-13,6

Таблиц а 2

12,5 14,8

11,7

Составитель В.Волкова Редактор 10.Середа Техред И.Попович

Заказ 4447/58 Тираж 347Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4

Корректор Н. Король

Изобретение касается производных пептидов, в частности хлоргидратов гептапептидов H Val-Pro-Pro-Leu-Gly- Trp-Met-Y-HCl, гдеТ-ОН, OCHj, которые обладают биологической активностью и могут найти применение в ветерина- .рии. Цель изобретения - создание более активных соединений указанного класса. Их синтез ведут из активированного этилхлорформиатом пептида Boc-Val-Pro-Pro-OH, и метилового эфира тетрапептида H-Leu-Gly-Trp-Met-OCH х к НС 1 в среде тетрагидрофурана в присутствии N-метилморфолина при (-12) С в течение 1ч, а затем при О - (+15)°С в течение 2 ч. Полученный продукт Boc-Val-Pro-Pro-Leu-Cly-Trp-Met- OCHj, в случае необходимости, оныляют едким натром в метаноле и защищенный пептид деблокируют обработкой хлористым водородом в присутствии анизола и 2-меркаптоэтанола. Испытания новых пептидов показьшают, что они малотоксичны и обладают более высокой способностью промотировать рост животных, чем известньй тетрапептид Туг- Pvo-Trp-Met-NH. 2 табл. СО