Способ культивирования бактерий Советский патент 1982 года по МПК C12N1/06 

( СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способов культивирования бактерий ка для производственных, так и для ис- следовательских целей. Известно, что для максимального накопления биомассы и продуктов жизнедеятельности любых микроорганизмов, в том числе бактерий, послед ним должны быть созданы благоприятные условия развития, включая сбалан сированный состав источников питания обеспечивающий физиологические потребности культуры или максимальное накопление требуемых продуктов их метаболизма.. Одним из путей решения этой задачи является повышение эффективности использования бактериями природных субстратов растительного или животного происхождения. С этой целью при родные субстраты подвергают процессу кислотного или ферментативного гидролиза и в среду как источник питания вносят соответствующий гидролизат. Известны способы культивирования бактерий, предусматривающие выращивание организмов как на средах, содержащих в качестве источника азота гидролизаты белкового материала, так и на средах, содержащих в качестве источника углерода гидролизаты углеводсодержащего сырья 1 и 2. В большинстве случаев недостающий источник питания, вводимый в среду, представляет собой индивидуальный сахар, чаще всего глюкозу, когда среда содержит гидролизат белкового материала, или негидролизованный источник азота, если среда содержит гидролизат углеводсодержащего сырья. Известен способ культивирования энтомопатогенных бактерий, заключающийся в выращивании микроорганизмов на среде, содержащей гидролизат белоксодержащего материала, негидролизованныи источник углеводов и свободные сахйра З}. Недостаток известного способа необходимость использования гидрола, являющегося отходом производства и поэтому продуктом нестандартным, а также ограничено доступным. Кроме того, присутствие в среде негидролизованного источника углерода (кукурузной муки) и свободных углеводов (гидрола) удлиняет цикл развития культуры за счет явления диауксии и двухфазного роста. Цель изобретения - интенсификация развития бактерий. Поставленная цель достигается за счет того, что в качестве источника углерода используют полностью гидролизованный углеводсодержащий материал. При этом энтомопатогенные бактерии типа Bacillus thuringiensis культивируют на среде, включающей гидролизат кукурузной муки 0,3-2,5 (по редуцирующим веществам) и гидролизованный на 2% БВК +0-90 мг (по аминному азоту). Молочно-кислые бактерии типа Lactabaci1lus acldophillus культив руют на среде, включающей гидролиза кукурузной муки 0,,0% (по редуцирующим веществам) гидролизованный на 100% БВК 100-1000 мг % (по аминн му азоту) и KittPOi, 0,3-0,6%. Источник углерода должен быть гидролизован полностью, чтобы исклю чить задержку развития культуры всл ствие диауксии. Белоксодержащее сыр должно быть гидролизовано на 2-100% в зависимости от особенностей выращиваемой культуры. Допустимо исполь зовать как кислотные, так и ферментативные гидролизаты. Конкретное соотношение источнико углерода и азота зависит от физиологических потребностей бактерий и характера метаболических процессов. Предлагаемый способ заключается в следующем. Предварительно готовят гидролиза белоксодержащего и углеводсодержаще го сырья. Углеводсодержащее сырье гидролизуют полностью, а белоксодер жащее сырье - в зависимости от известных потребностей используемой культуры бактерий. Если, например, культура требует на начальных стадиях развития относительно высоких концентраций источника азота - используют гидролизат белоксодержащего материала более высокой степени расщепления. На основе приготовленных гидролизатов готовят среду для культивирования бактерий, исходя из известных потребностей культуры в источниках азота и углерода. При необходимости в состав среды могут быть введены дополнительные компоненты. Среду стерилизуют обычным образом и осуществляют на ней культивирование требуемой культуры. Пример 1, На основе предварительно приготовленного гидролизата кукурузной муки, гидролизованной до (ПОЛНОГО расщепления, углеводов и гидролизата белково-витаминного комплекса (ВБК), гидролизованного на 2, готовят среду следующего состава:Гидролизат кукурузной муки1,5 вес.% Гидролизованный на 2% БВК До конечноного содержания аминного азота 70 мг% (по аминному азоту) ВодаДо 1 л Среду стерилизуют при 0,7 эти в течение 30 мин и стерильно разливают в колбы. Среда имеет рН 7,О ±0,2. Посевной материал - культура Вас. thuringiensis var dendrolimus которую выращивают на агаровой среде в течение 3 сут, смывают клетки стерильной водой и вносят в культуральную среду в количестве 2 об.%. Культивирование проводят на качалке при 50 об/мин при . Процесс ферментации составляет 28 ч. При этом наблюдается синхронное спорокристаллообразование. Титр культуральной жидкости составляет млрд, спор/мл. По сравнению с известным способом достигнуто сокращение времени культивирования на 10 ч без снижения конечного титра культуральной жидкости. Использование предлагаемого состава среды повышает экономичность процесса, так как среда является более дешевой и содержит более низкое количество сухих нерастворимых веществ, обеспечивая снижение потерь целевого продукта на этапе его выделения. П р И м е р 2. Готовят плотную питательную среду следующего состава:Гидролизат До конечного со ку куру зной держания в сремукиде редуцирующих веществ О,3 вес Гидролизо- До конечного со ванный на 2% держания в сред БВК60 мг аминного Агар2 вес.% Среду стерилизуют при 1,2 атм в течение 20 мин, и разливают в чашк Петри, Среда имеет рН 7,1. На среду петлей высевают культуру Вас. thuringiensi5 v. kuzstaki из лиофилизированного состояния. На среде вырастают крупные колонии в Р-форме с сильно складчатой (морщинистой) поверхностью. Микросколическое исследование культуры различ ного возраста показывает наличие од нородных по форме и размерам клеток которые одинаковым образом окрашиваются. Процесс споро- и кристаллообразования у культуры отличается синхронностью и заканчивается за 3 сут. Параллельный высев культуры на общепринятую среду (МПА) приводит к изменению морфологических и культу ральных свойств, к нарушению си.нх ронности споро- и кристаллообразова ния, к удлинению цикла развития кле ток до 6-7 сут, к появлению бескри таллических форм культуры, что в общем характеризует признаки ее выр дения . . П р и м е р 3. Готовят питательную среду следующего состава: До конечнбго Гидролизат кукурузной содержания редуцирующих вемукиществ 1 ,5 ГидролизоДо конечного с держаний аминванный на 100 БВК ного азота 150 мг 0,51 До 1 л Вода Среду стерилизуют при 0,7 атм в течение 30 мин. Среда имеет рН 6,6. Среду засевают суточной культурой Lactobac. acidophi1lus, предварител но выращенной на молочной сыворотке, и культивируют без аэрации, но при периодическом перемешивании течении 18 сут. Путем добавления ра 6« створа едкого наТра поддерживают в процессе культивирования рН 6,7. Полученный титр культуральной жидкости составляет 2,2 млрд/мл. Параллельное выращивание культуры на обычно используемых средах приводит к достижению титра на уровне 0,8 млрд/мл. Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет сократить срок выращивания бактерий, без снижения конечного титра культуры или повысить титр бактерий при той же длительности культивирования. Одновременно достигается упрощение способа за счет использования практически двухкомпонентных сред, снижение расхода питательных компонентов за счет более полной их утилизации оказывается возможным сократить расход пищевых продуктов (в частности, глюкозы) для выращивания бактерий. Формула изобретения 1.Способ культивирования бактерий, включающий их высев на среду, содержащую источник углерода и источник азота в .виде гидролизата белоксодержащего материала, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, в качестве источника углерода используют полностью гидролизованный углеводсодержащий материал. 2.Способ культивирования энтомопатогенныХбактерий типа Bacillus thuringiensis по п. 1, отличающий с я тем, что культивирование проводят на среде, включающей гидролизат кукурузной муки 0,3-2,5% (по редуцирующим веществам) и гидролизованный на 2 БВК мг% (по аминному азоту). 3.Способ культивирования молочнокислых бактерий типа LactobacMlus acidophlllus по п. 1, отличающий ся тем, что культивирование проводят на среде, включающей Гидролизат кукурузной муки 0,5 2,0% (по редуцирующим-веществам), , гидролиэованный на 100% БВК 1001000 мг% (по аминному азоту) и 0,3-0,6%.

79395 68

Источники информации.2. Авторское свидетельство СССР

принятые во внимание при экспертизе№ 458575, кл. С 12 В 3/08, 1973.

, ,3. Авторское свидетельство СССР

Г 582282, кл. С 12 N 1/06, 197.5 (прототип).