ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS AWAMORI - ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ Российский патент 2005 года по МПК C12N9/34 C12N1/14 C12N9/34 C12R1/665 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности для получения глюкоамилазы с целью дальнейшего ее применения для осахаривания (гидролиза) крахмалосодержащего сырья в спиртовой, хлебопекарной, крахмало-паточной и пивоваренной промышленности.

Глюкоамилаза - (α-1,4-глюкан-глюканогидролаза, 3.2.1.3.) глюкозообразующая амилаза, экзофермент, атакует крахмал с нередуцирующего конца полисахаридной цепочки, последовательно отщепляя глюкозные остатки и полностью превращая крахмал в глюкозу.

Большинство глюкоамилаз микробного происхождения относятся к “кислым” ферментам, проявляющим максимальную активность при рН 3,5-5,5, и оптимумом температуры 55-60°С; обладают широкой субстратной специфичностью.

Отличительной особенностью глюкоамилаз является их способность гидролизовать как α-1,4, так и α-1,6 глюкозидные связи в полисахаридах и олигосахаридах (даже в низкомолекулярных, таких как паноза и изомальтоза). Вследствие этого глюкоамилаза является основным ферментом при осахаривании крахмалосодержащего сырья, а штаммы микроорганизмов, продуцирующие активную глюкоамилазу, имеют широкие перспективы применения во многих отраслях биотехнологии.

Известны штаммы - продуценты глюкоамилаз и способы из культивирования, которые различаются главным образом видами применяемых штаммов грибов, субстратами, используемыми для ферментации и условиями проведения процесса. Стоимость получаемых ферментов определяется уровнем активности глюкоамилазы в культуральной жидкости, скоростью и продуктивностью синтеза ферментов, выходом ферментов с единицы использованного субстрата, стоимостью субстрата.

Активными продуцентами глюкоамилазы являются микроорганизмы многих таксономических групп, таких как грибы рода Rhizopus - R.delemar, R.fonkinsis, R.neveus, R.tonnensis, R.japonicum, R.topnineusis, отдельные представители Neurospora crassa и Mucor дрожжи и дрожжеподобные грибы родов Candida, Saccharomyces, Endomycopsis и Endomyces.

В мировой практике одними из основных продуцентов глюкоамилазы являются штаммы грибов рода Aspergilllns - Asp. niger, Asp. oryzae, Asp. usamii, Asp. awamori, Asp. batatae, в том числе рекомбинантные. Использование рекомбинантных штаммов связано с необходимостью проведения постоянных исследований по поддержанию штаммов в стабильном и активном состоянии, созданием специальных условий культивирования, которые не всегда доступны при промышленном ведении процесса.

В литературе описан продуцент глюкоамилазы Asp. awamori 466, который при выращивании на среде с кукурузной мукой, осахаренной солодовым молоком, с добавлением диаммонийфосфата на 184 часа роста синтезирует 183 ед/мл [Авторское свидетельство СССР N 800185, С 12 D 13/10, 1981].

Известен штамм Asp. awamori ВУД Т-2 F -203, который при культивировании на среде с кукурузной мукой, осахаренной солодовым молоком или бактериальной амилазой, при специальной подготовке посевного материала и многостадийности процесса на 130 ч культивирования, обеспечивает активность глюкоамилазы (ГлА) в культуральной жидкости до 200 ед/мл [Авторское свидетельство СССР N 1259673, C 12 N 9/34, 1982].

Известен продуцент глюкоамилазы - штамм Asp. awamori ВНИИгенетика 120/177 ЦМПМ F-166 [Авторское свидетельство СССР N 1271068, C 12 N 9/34, 1979]. Штамм выращивают на агаризованной среде с кукурузным экстрактом, для получения посевного материала культивируют на среде, содержащей крахмал, солодовые ростки и минеральные соли. Ферментационная среда содержит кукурузную муку, кукурузный экстракт, бактериальную амилазу. Для повышения синтетической активности штамма используют 2-х стадийную подготовку посевного материала, включающую сначала получение спорового материала на среде с пшеничными отрубями, затем проращивание его на жидкой среде ферментационного состава и последующее культивирование на среде, содержащей кукурузную муку, крахмал, БВК и диаммонийфосфат, при 34°С. Активность глюкоамилазы на 120 ч культивирования составляет 340 ед/мл.

Недостатком вышеуказанных штаммов является низкая продуктивность по глюкоамилазе, сложность процессов (стадий) ведения и подготовки посевного материала, использование многокомпонентных дорогостоящих питательных сред для производственных ферментаций, и как следствие этого - низкая рентабельность технологии производства глюкоамилазы.

Известен мутантный штамм Asp. awamori N 400 (ВКМ F-3689 D) [Заявка на выдачу патента РФ N 2000116928, C 12 N 9/34, опубл. 27.05.2002]. Посевной материал Asp. awamori ВКМ F-3689 D выращивают на твердой питательной среде, состоящей из 50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 35°С на качалке с 240 об/мин в течение 144 часов. Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 144 ч роста составляет 500 ед/мл.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Asp. awamori ВУД Т-2, вариант 3485, который при культивировании в глубинных условиях в течение 168 ч на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода гидролизат муки злаковых культур синтезирует глюкоамилазу с активностью от 350 до 589 ед/мл [А.П.Синицын, О.Н.Окунев, В.Ю.Матыс, А.В.Кошелев, Н.В.Цурикова. Производство спирта и ликероводочных изделий, 2001, № 3, стр. 16-18].

Однако указанный штамм имеет не достаточно высокую активность.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - получение нового высокопродуктивного штамма-продуцента глюкоамилазы, способного при культивировании на дешевых технологичных средах обеспечивать высокий уровень активности глюкоамилазы и выход фермента с единицы массы использованного субстрата.

Технический результат заключается в получении штамма- продуцента, обеспечивающего значительно более высокую активность глюкоамилазы в культуральной жидкости при культивировании на дешевых технологичных средах.

Сущность объекта изобретения - новый специально селекционированный штамм Aspergillus awamori М-2002 (ВКМ F-3771D ) - продуцент глюкоамилазы.

Штамм Aspergillus awamori М-2002 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под № ВКМ F-3771D.

Штамм получают с помощью многоступенчатой генетической селекции штамма Asp. awamori ВУД Т-2 F-203 с использованием в качестве метода мутагенеза ультрафиолетового облучения.

Суспензию спор исходного штамма Asp. awamori ВУД Т-2 F-203 (титр разведения - 10^-4-10^-6) облучают ультрафиолетом в 20%-ном глицерине в течение 4-5 мин. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, выживаемость при этом составляет 1-2 %. Засеянные чашки инкубируют в течение 7 суток при 35°С и дополнительно выдерживают 7 суток при 22-23°С. Каждую выросшую колонию пересевают на чашки, содержащие агаризованные селективные среды. Наиболее продуктивный вариант подвергают повторной обработке, УФ-облучению и селекции.

Схема мутагенеза и селекции следующая (указаны усредненные диапазоны активности):

Исходный штамм Asp. awamori ВУД Т-2 F-203 (200 ед/мл)

↓ (УФ-облучение, селекция)

Мутант Asp. awamoriВУДТ-2 1000У(BKM F-3765D) (600-800 ед/мл)

↓ (УФ-облучение, селекция)

Мутант Asp. awamori M-2002 (BKM F-3771D) (800-1000 ед/мл)

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой Чапека или Мальц-агаре при +4°С с обязательным пересевом не реже одного раза в 3 месяца.

Культурально-морфологические признаки штамма Asp. awamori BKM F-3771D.

Макроскопические характеристики: колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 25°С, имеют диаметр 30-35 мм/7 сут, слабо радиально-бороздчатые, поверхность бархатистая, край тонкий (1-2 мм), конидиальная область темно-коричневая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 37°С, имеют диаметр 26-30 мм/7 сут, слабо радиально-борозчатые, поверхность шерстистая, край тонкий (1 мм), конидиальная область серовато-коричневая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S), 25°С, имеют диаметр колонии 26-28 мм/7 сут., гладкие, поверхность клочковато-шерстистая, край до 5 мм, конидиальная область темно-коричневая до черной; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на Мальц-агаре (МЕА), имеют диаметр 35-40 мм/7 сут, радиально-борозчатые, поверхность клочковато-шерстистая, край неровный, до 6 мм конидиальная область темно-серая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Микроскопические характеристики: конидиальные головки шаровидные, затем рыхлорадиальные, распадающиеся на отдельные колонки, конидиеносцы слабо окрашенные в терминальной части, гладко стенные 250-1200 × 6-12 мкм, апикальные расширения шаровидные 20-45 мкм в диаметре, покрыто стеригмами по всей поверхности. Стеригмы преимущественно двухъярусные, метулы 6-16 × 3,5-7 мкм, фиалиды 5-8 × 2-4 мкм. Конидии шаровидные, 3,5-6 мкм, гладкие.

Физиолого-биохимические свойства штамма

Отношение к сахарам. Культура штамма хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, арабинозу, рафанозу, и слабо - мальтозу, лактозу, галактозу и рамнозу. Крахмал гидролизует до глюкозы.

Хорошо ассимилирует аммонийные соли неорганических кислот. Потребляет пептон, казеин, аминокислоты. Пептонизирует молоко.

Температурный оптимум роста 34-35°С, рН 4,5-6,0. Аэроб.

Данный вид мипелиального гриба не числится в качестве патогенного в “Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения”.

Полученный мутант по своим морфологическим свойствам отличается от исходного интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор, окраской колонии с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах, образованием более обильной биомассы, повышенной способностью к биосинтезу глюкоамилазы при глубинном культивировании на жидких средах.

При рассеве мутантного штамма Asp. awamori BKM F-3771D на селективные среды наблюдается выщепление 8-10% нетипичных колоний, что свидетельствует о высокой морфологической стабильности штамма и, следовательно, о его стабильности к продукции глюкоамилазы при длительном культивировании.

Культивирование мутантного штамма Asp. awamori BKM F-3771D осуществляют в аэробных условиях при температуре 35°С в течение 168-192 ч, рН среды 5,2-5,5. Для роста культуры и биосинтеза глюкоамилазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, экструдат муки злаковых культур (кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи), аммонийный азот, кукурузный экстракт.

Штамм Asp. awamori BKM F-3771D при культивировании на среде в течение 192 ч, содержащей гидролизат кукурузной муки или гидролизат экструдата кукурузной муки, обеспечивает активность в культуральной жидкости от 800 до 1080 ед/мл.

Для ферментативной обработки крахмалосодержащего сырья при производстве спирта ферментный препарат может быть использован в виде культуральной жидкости (Глюковамарин Гх), или в виде ультраконцентрата (Глгоковамарин Г18х), или в виде концентрированных препаратов, получаемых известными биохимическими методами, например, осаждением этанолом из ультрафильтрата культуральной жидкости (Глюковамарин Г20х).

Глюкоамилаза активна в широком диапазоне рН - от 3,0 до 8,0 с оптимумом при рН 4,2-5,0; в диапазоне температуры от 30° до 75°С с оптимумом при 60-65°С.

Глюкоамилаза обладает высокой стабильностью в широком диапазоне рН, лишь при рН 2,0 и 8,0 наблюдается ее существенная инактивация. Фермент стабилен в течение 2-х часов при 45-55°С; инкубирование при температуре 60°С в течение 2-х часов приводит к снижению активности на 40%. Инкубирование при температуре 65°С в течение 1 часа снижает активность фермента штамма на 40-45%.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал получают выращиванием штамма Asp. awamori BKM F-3771D на твердой питательной среде, состоящей из 80% пшеничных отрубей и 20% солодовых ростков, увлажненных водопроводной водой до 60%, рН среды - 5,2-5,5. Выращивание спорового посевного материала осуществляют в колбах, содержащих 25-35 г твердого субстрата, в стационарных условиях при температуре 35°С в течение 5-6 суток и при 22-23°С в течение 10 суток.

Полученный посевной материал в количестве 0,08-0,1% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 100 мл среды состава, г/л: кукурузная мука - 240,0; водопроводная вода - остальное, рН среды 5,2-5,5.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 35°С на качалке с 240 об/мин в течение 168-192 ч. Каждые 24 ч, начиная с 72 ч роста, отбирают пробы, в которых определяют активность глюкоамилазы.

Метод определения активности глюкоамилазы основан на определении глюкозы, образовавшейся при гидролизе растворимого крахмала ферментом. За единицу глюкоамилаэной активности принимают такое количество фермента, которое, действуя на растворимый крахмал при 30°С и рН 4,7 в течение 1 мин, освобождает 1 мкмоль глюкозы [Препараты ферментные. ГОСТ 20264 - 4.89. - М.: Изд. Государственный комитет СССР по стандартам, 1995. - 70с.].

Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 168 ч роста составляет 820 ед/мл, на 192 ч роста - 880 ед/мл, содержание растворимого белка в культуральной жидкости - 25 мг/мл, удельная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости равна 36,0 ед/мг белка.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в ферментационной среде вместо кукурузной муки используют экструдат кукурузной муки в количестве 300 г/л.

Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 192 ч роста составляет 1080 ед/мл.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но ферментационная среда вместо кукурузной муки содержит пшеничную муку в количестве 300 г/л.

Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 192 ч роста 840 ед/мл.

Пример 4. Биосинтез глюкоамилазы исходным и мутантными штаммами Asp. awamori.

Получение посевного материала исходного и мутантных штаммов Asp. awamori осуществляют по примеру 1.

Полученный посевной материал в количестве 0,08-0,1% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 100 мл среды состава, г/л: кукурузная мука - 240,0 (среда №1) или экструдат кукурузный муки (ЭКМ) - 280,0 (среда №2); водопроводная вода - остальное, рН среды 5,2-5,5.

Культивирование штаммов осуществляют в аэробных условиях при температуре 35°С на качалке с 240 об/мин в течение 168-192 ч. Каждые 24 ч, начиная с 72 ч роста, отбирают пробы, в которых определяют активность глюкоамилазы.

В таблице 1 представлены данные по биосинтезу глюкоамилазы исходными и мутантными штаммами Asp. awamori.

Полученные данные свидетельствуют об увеличении активности глюкоамилазы в культуральной жидкости заявляемого штамма Asp. awamori F-3771D по сравнению с исходным штаммом Asp. awamori ВУД F-203 более чем в 4 раза и по сравнению с наиболее активным из известных штаммов-мутантов практически в 2 раза.

Таблица 1Биосинтез глюкоамилазы различными штаммами Asp. awamori.№ШтаммПитательная средаГлА, ед/мл1Asp. awamori ВУД Т-2 F-203 (исходный)Среда № 1220  Среда.№22652Asp. awamori ВУД Т-2 вариант 3485 (прототип)Среда № 1420  Среда № 25803Asp. awamori ВУД Т-2 1000y, BKM F-3765DСреда № 1530  Среда № 26504Asp. awamori M-2002, BKM F-3771DСреда.№ 1880  Среда № 21080

Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus awamori BKM F-377 1D при культивировании на дешевых питательных средах, традиционно применяемых в производстве ферментных препаратов, обеспечивает более высокую глюкоамилазную активность культуральной жидкости по сравнению с известными штаммами-мутантами, что позволяет в значительной степени повысить выход глюкоамилазы с единицы субстрата (кукурузной муки или ее экструдата) и, соответственно, удешевить процесс производства ферментных препаратов, получаемых на его основе.

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано для осахаривания крахмалистого сырья в различных отраслях пищевой промышленности, где требуются высокоактивные ферментные препараты, устойчивые к кислым значениям рН. Штамм Aspergillus awamori BKM F-377 ID получен многоступенчатой генетической селекцией исходного штамма Aspergillus awamori ВУД Т-2 F-203 с применением ультрафиолетового облучения. Штамм обладает высокой глюкоамилазной активностью. Для получения высокой продуктивности штамма могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов, не требуется использования сложных приемов культивирования продуцента. 1 табл.

Штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori BKM F-3771 D Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН - процент глюкоамилазы.