Способ культивирования энтомопатогенных бактерий Советский патент 1984 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к области технической микробиологии и может быть использовано для получения энт мопатогенньпс препаратов, являющихся .средствами защиты растений. Известен способ культивирования бактерийвида Вас, thuringiensis в лабораторных условиях на дрожжеполи сахаридной среде, содержащей 3% кор мовых дрожжей (БВК) и 1,5% кукуруз- ной муки при постоянном режиме аэра ции L1 3. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному является способ культивирования энтомопатоге ных бактерий на среде следующего, состава, %: кормовые дрожжи 3,0-4,5 кукурузная мука 1,2-2,5; гидрол 2,0 4,0 и гидролизат хлопкового шрота 3,4-6,8 с содержанием аминного азот 300-400 мг% С2. Недостатком указан ных способов является относительно низкий выход споровой биомассы энтомопатогенньк бактерий. Целью изобретения является увели чение титра cnoij микроорганизмов. Это достигается за счет сокращения в составе среды количества гидрола и гидролизата хлопкового шрота при соответственном изменении режима аэрации, заключающемся снижении уровня аэрации в процессе культивир .вания. В соответствии с предлагаемым способом энтомопатогенные бактерии вьфащивают на среде следующего сост.ава, вес.%: Дрожжи кормовые. 2,0-4,6 Мука кукурузная 1,2-2,4 Гидрол . -0,571,5 Гидролизат хлопкового шрота 3,0-14 ВодаОстальное. При этом уровень аэрации с начала процесса до момента полного спор образования составляет 0,33 1,4 об/об мин, а с момента йолного спорообразования до момента освобож дения спор у 10% бактерий 0,15 0,5 об/об мин, после чего аэрацию прекращают. Существо способа заключается в следующем. . Предварительно готовят питательную среду. Для этого дрожжи и муку смешивают с водопроводной водой в количестве 60% от необходимой для приготовления соответственного объе 2 ма среды. Суспензию перемешивают, нагревают до и вьщерживают при этой температуре 20 мин, далее добавляют ферментативный гидролизат хлопкового шрота, оставшуюся воду и охлаждают до 40-45 0. Доводят рН до 7,6+0,1 20%-ным раствором NaOH. Среду стерилизуют при температуре в течение 30 мин. Отдельно готовят стерильньш гидрол. Срерилизацию гидрола проводят при 120С в течение 25 мин. Стерильный гидрол добавляют в среду непосредственно перед посевом культуры.. Ферментативный гидролизат готовят следующим образом. Водопроводную воду нагревают до температуры 53+2С загружают 2% от взятой воды хлопкового шротаJ добавлением раствора едкого натра устанавливают рН суспензии 8,0+0,2. После чего добавляют фермент протосубтилин ГЗХ (с активностью не менее 100 ед. по модифицированному методу Ансона) в, количестве 0,8-1% от навески шрота. Процесс гидролиза проводят в течение 4 ч при постоянном перемешивании, поддержании температуры и ,рН в указанных вьш1е пределах. По окончании пиролиза суспензию нагревают до , вьщерживают при этой температуре 20 мин, после, чего мешалку отключают, прсле отстаивания гидролизата в течение 20 мин проводят его Декантацию и с помощью вакуума переводят в другой реактор. Готовьй гидролизат содержит около 40 мг% аминного азота. Подготовленную описанным выше способс м питательную среду зас.евают штаммом энтомопатогенных бактерий. Культивирование осуществляют в течение 32-35 ч при дробном режиме аэрации. С начала продесса и до момента полного спорообразования обеспечивают максимальный режим аэрации, составляющий 0,33-: 1,4 об/об мин в зависимости от объема ферментера. Момен-том полного спорообразования счита-. ется такое состояние культуры, при котором не менее чем у 95% клеток сформировались зрелые споры, определяемые методом прямого микроскопирования. Затем интенсивность аэрации сокращается до уровня 0,150,5 об/об мин и поддерживается на таком уровне до момента, при .котором не менее чем у 10% клеток освобождаются споры. После этого аэрированне среды полиостью прекращается и полученная культуральная жидкость направляется на переработку. Пример 1. Готовят 7 л среды следующего состава,.вес.%: Дрожжи кормовые Мука кукурузная Гидрол Гидролизат хлопкового шрота ВодаОстальное Культивирование проводят в лабора торном ферментере объемом 10 л. Посе среды осуществляют суспензией спор бактерий Bacillus thoringiensis var. galleriae шт. 69/6 в количестве 30 МП с концентрацией спор 10 спор/м Непосредственно после посева обеспечивают интенсивность аэрации 1 об/об мин, поддецживая ее на этом уровне до 22 ч роста. В этот момент 95% клеток содержит сформировавшиеся споры После чего интенсивность аэрации снижают до 0,3 об/об мин и, куль ивирование продолжают еще 10 ч После 32 ч аэрации у 12% клеток спор выходят из культуральной жидкости и этот момент аэрация полностью прекра щается Культуральную жидкость выдер живают еще в течение 5 ч на холоде до полного освобождения спор от клеточных оболочек. Титр спор составляе 9,00 110 спор/мл. Пример 2. Культуру Bac.thuringiensis v, Hendrolimus шт.87-продуцент дендробациплина выращивают в ферментере объемом 630 л на среде этого же состава, что ив примере 1. В течение 23 ч аэрацию поддерживают на уровне 1,4 об/об мин. На двадцать третий час 99% клеток содержит сфор мировавшиеся споры и в этот момент интенсивность аэрации снижена до 0,5 об/об мин. В таком режиме.культивирование продолжается до момента, выхода спор у 15% клеток, что имеет место на двадцать девятьй час куль.тивирования. После этого аэрацию полностью прекращают, в рубашку ферментера подают холодную воду и выдерживают Культуральную жидкость в течение 5 ч до 98% выхода спор из клеток. Титр спор со.ставляет 10,08МО спрр/мл. Пример 3. Культуру Вас. thuringiensis v. dendroliraas шт. 49/8продуцент дендробациллина выращивают в ферментере емкостью 63 м на-среде того же состава, что в примере 1. В течение 22 ч интенсивность аэрации составляет 0,33 об/об мин. На пвапиять втооой час 95% клеток сопеожит :формировавшиеся споры и в этот момент интенсивность аэояиии уменьшена до 0,17 об/об мин. В этом режиме культи ирование продолжается до момента выхода спор у 10% клеток, что имеет место на тридцать второй час культивирования. После этого аэрацию полностью прекращают, Культуральную жидкость охлаждают до 20 С и вьщерживают еще- 3ч. Титр спор составляет 9,4-10 спор/мл. Таким образом, предложенный способ культивирования бактерий вида Вас. thuriengiensis может быть использован для получения энтомопатоген ных препаратов на основе различных вариантов этого микроорганизма как в лабораторных, так и в промышленных условиях. Предложенный способ обеспечивает повьшение выхода спор по сравнению с промьштенно-освоенным способом более чем в 3 раза.

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ включающий высев бактерий на среду, содержащую кормовые дрожжи, кукурузную муку, гидрол, гидролизат хлопкового шрота и а&рацию в дробном режиме, отличающийся тем, что, с целью увеличения спор, культивирование осуществляют на среде, содержащей, вес.%: Дрожжи кормовые 2,0-4,0 Мука кукурузная 1,2-2,4 . Гидрол.0,5-1,5 Гидролизат хлопкового шрота 3,0-14,0, Вода. Остальное а аэрацию до полного спорообразоваV) С .ния поддерживают на уровне 0,33 1,40 об/об мин и затем снижают до 0,15-0,5 об/об мин. ч ч со