СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ПЕКТИН-ЛИАЗЫ Российский патент 2005 года по МПК C12N9/88 C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам производства бактериальных ферментов мацерирующего действия.

К таким ферментам относится пектин-лиаза, получаемая в процессе глубинного культивирования Bacillus circulans. Из культуральной жидкости (далее по тексту - к.ж.) в дальнейшем получают технический ферментный препарат Мацеробациллин ГЗх-СХ по ТУ 9291-037-34588571-2001.

Данный препарат предназначен для использования в составе мультиэнзимных композиций для обработки комбикормовой продукции преимущественно пшеничной основы с введением зерна овса, проса, пшеничных отрубей, а также в других отраслях, где необходима мацерация растительных материалов.

Исходной стадией получения Мацеробациллина Г3х-СХ является глубинное культивирование бактерий Bacillus circulans в ферментационных аппаратах. Полученную к.ж. фильтруют и стандартизованный солями фильтрат обезвоживают на распылительной сушилке типа СРЦ.

Результативность получения товарного препарата пектин-лиазы во многом зависит от состава питательной среды, условий культивирования и последующей сушки подготовленной к.ж. Способы глубинного культивирования бактериальных продуцентов Bacillus circulans и составы питательных сред хорошо изучены на лабораторном и полупромышленном уровнях.

Так, в работе "Способ получения бактериального ферментного препарата мацерирующего действия", Г.Б.Бравова, В.И.Дуда и др., Авторское свидетельство СССР №817052, кл. С 12 N 9/06, от 15.10.79 г., выращивание культуры Bacillus circulans 31 проводят в ферментере вместимостью 250 дм³ при температуре от 37 до 42°С в течение от 20 до 24 ч на питательной среде со значением водородного показателя от 8,0 до 8,4 единиц рН состава, %:

свекловичный жом 2,0

мел 0,5

гидрофосфат аммония 0,75

дигидрофосфат калия 0,1

кукурузный экстракт 0,5

Полученную к.ж. с содержанием пектин-лиазы до 2,0 ед/см³ подают на фильтрацию для отделения биомассы и нерастворимых остатков питательной среды, фильтрат концентрируют при температуре 30 °С на вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ (далее по тексту - СВ) 11.5%. К концентрату добавляют 0,1% хлорида кальция и 11,5% хлорида натрия и высушивают на распылительной сушилке.

В работе Г.Б.Бравовой, Т.Е.Смирновой и др. "Питательная среда для культивирования продуцента мацерирующих ферментов Bacillus circulans-31", Авторское свидетельство СССР №1116058, кл. С 12 N 1/20, 30.09.1984, авторы используют для культивирования Bacillus circulans-31 питательную среду следующего состава, %:

свекловичный жом 1-4

гидроокись калия 0,1-0,3

сернокислый калий 0,1-0,4

углекислый кальций 0,02-0,3

мочевина 0,2-0,8

кукурузный экстракт 0,2-1,5

сернокислый марганец 0,02-0,12

оксигенальное комплексное

соединение кобальта (II) с

углеродсодержащим лигандом

(по металлу) 0,0003-0,0042

При этом достигается накопление пектин-лиаз до 890 ед/см³.

Данный метод получения пектин-лиазных ферментов принимаем за прототип.

Целью изобретения является увеличение выхода ферментного препарата пектин-лиазы путем применения более продуктивной и технологичной питательной среды, в которой углеводные компоненты не образуют заторов и хорошо подвергаются термической стерилизации, и которая, в сочетании с найденным режимом подготовки объекта к обезвоживанию (по значению водородного показателя), обеспечивает резкое снижение термических потерь на стадии распылительной сушки. Поставленная цель достигается тем, что предлагается способ получения пектин-лиазы с использованием ферментационной среды, где в качестве источника углеводов используют муку кукурузную или смесь муки кукурузной и отрубей пшеничных, или крахмал кукурузный (картофельный), гидролизованные до доступных сахаров амилазой бактериальной, что при ферментации резко повышает выход пектин-лиазы до 34100 ед/см³, также резко повышает термическую устойчивость фермента при обезвоживании.

Одновременное изменение режима подготовки к.ж. или фильтрата из нее по значению водородного показателя путем введения растворов кислот (соляной, фосфорной) до 6,0-7,8 единиц рН позволяет дополнительно повысить термоустойчивость пектин-лиазы до 12,2%.

Сущность изобретения заключается в использовании вместо продуктов щелочной деградации пектина свекловичного жома в составе питательной среды крахмалосодержащего сырья - мука кукурузная (от 2,75 до 3,0%) или крахмал кукурузный (картофельный) (2,75%), или смесь муки кукурузной (до 3%) с отрубями пшеничными (до 4%) - и изменении значения водородного показателя стандартизованных солями фильтрата или к.ж. перед обезвоживанием.

Кукурузную муку с содержанием крахмала 65-70%, отруби пшеничные с содержанием крахмала 50-55%,кукурузный или картофельный крахмал, идущие на приготовление питательных сред, обрабатывают амилазой бактериальной при определенных условиях. Используют препарат амилосубтилин с активностью 1000 ед/г из расчета 2-3 ед на 1 г крахмала. Сырье вносят в нагретую до температуры 40-45°С воду, добавляют 2/3 расчетного количества амилосубтилина. Кислотность среды поддерживают на уровне 6,5-6,7 едким натром. Суспензию нагревают до 80-85°С и выдерживают при этой температуре 30 минут. Затем ведут нагрев до кипения и выдерживают в течение часа, после чего охлаждают до 70-75°С, добавляют оставшуюся часть амилосубтилина. Гидролиз крахмала ведут в течение 2 часов до образования продуктов неокрашивающихся йодом. При этом уровень свободных сахаров, замеренных по Бертрану, увеличивается в 10-15 раз. Белки, входящие в состав крахмалосодержащего сырья в этом процессе гидролизу не подвергается, содержание аминного азота остается без изменения. Гидролиз клейстеризованного крахмала до декстринов ведется для снижения вязкости питательной среды.

Указанные составы питательных сред обеспечивают в оптимальных регламентных условиях культивирования получение к.ж. с содержанием пектин-лиазы до 34100 ед/см³. В полученную к.ж. или фильтраты из нее после фильтрования добавляют 0,1% хлорида кальция и хлорида натрия до значения 10-15% по СВ, доводят значение водородного показателя от 6,0 до 7,8 единиц рН растворами соляной или фосфорной кислот. Все это приводит к снижению термических потерь до 3%, получению концентрата с активностью фермента до 329000 ед/г и достижению общего выхода в готовом препарате до 89,3%.

В качестве примеров рассмотрим процессы получения препарата Мацеробациллин Г3х-СХ с применением бактериального продуцента Bacillus circulans ВКМП-В-5622.

Пример 1

Получение пектин-лиазы с применением культуры Bacillus circulans ВКМП-В-5622 проводят в ферментере вместимостью 500 дм³ при объеме питательной среды 250 дм³, имеющей следующий состав, %: мука кукурузная 3,0; калий сернокислый 0,2; мел химически осажденный 0,25; экстракт кукурузный 1,25; мочевина 0,75, пеногаситель 0,1. Кукурузную муку предварительно гидролизуют амилазой бактериальной при соотношении муки и водопроводной воды 7,5:140. Полученный гидролизат подщелачивают концентрированным раствором едкого натра до значения водородного показателя 7,5 единиц рН, вводят пеногаситель и стерилизуют. После охлаждения до температуры 60°С в эту порцию среды стерильно вносят вторую порцию среды, состоящую из кукурузного экстракта, мочевины, калия сернокислого, мела и части пеногасителя. Затем среду охлаждают до температуры 42°С, значение водородного показателя начальной среды 8,4 единиц рН. Среду засевают споровым посевным материалом. Культивирование первые 2 ч проводят без подачи воздуха; в фазе ускорения роста аэрацию проводят 0,6 объемами воздуха на объем к.ж./мин при температуре 40°С; в экспоненциальной и стационарной фазах роста осуществляют аэрацию 1,0 объемом воздуха на объем к.ж./мин при температуре 39°С. В течение всего процесса ферментации проводят перемешивание к.ж. Избыточное давление в течение всего культивирования составляет (0,4-0,5) кгс/см². Время роста 18,0 ч.

В результате через 18 ч получают культуральную жидкость с содержанием пектин-лиазы 34100 ед/см³, СВ 3,0% и значением водородного показателя 8,6 единиц рН. К.ж. фильтруют через металлическую сетку с размером ячеек 1 мм для удаления твердых частиц. В полученный фильтрат с содержанием СВ 2,8% вносят по 0,1% хлорида кальция и до 10% хлорида натрия. Значения водородного показателя в образцах стандартизованного фильтрата устанавливают концентрированным раствором соляной кислоты на уровне от 6,0 до 8,6 (исходный) единиц рН. Подготовленные фильтраты высушивают на распылительной сушилке "Ангидро" в режиме: температура сушильного агента на входе в сушильную камеру (135±3)°С, температура отходящего воздуха из камеры (65±3)°С. В результате сушки получают образцы концентратов, свойства которых отражены в таблице 1.

Таблица 1Свойства концентратов из к.ж., полученной на кукурузной муке№
образцаСвойства исходного фильтратаСвойства концентратаТермические потери при сушке % рНПлА, ед/см³ПлА, ед/гСВ, % 18,63360026400098,214,927,83380028600098,06,337,23290032000098,33,846,83270031100098,22,756,53150032900097,94,666,03080027500098,18,7

Полученные данные свидетельствуют в целом о резком снижении термических потерь пектин-лиазы при обезвоживании подготовленных фильтратов, полученных на среде с использованием кукурузной муки, при исходных значениях водородного показателя к.ж. составляют 14,9%.

Обезвоживание фильтратов из к.ж., полученной на кукурузной муке, в более узком интервале значений водородного показателя от 6,0 до 7,8 единиц рН позволяет дополнительно снизить термические потери пектин-лиазы до уровня от 2,7 до 8,7%.

Общий выход процесса для образцов 1-6 составлял от исходного в к.ж. от 73,6 до 78,4%.

Пример 2

Культивирование бактерий Bacillus circulans ВКМП-В-5622 осуществляют в ферментерах вместимостью 16 дм³ при объеме питательной среды 8 дм³, имеющей следующий состав, %: крахмал кукурузный или картофельный 2,75; калий сернокислый 0,2; мел химически осажденный 0,25; экстракт кукурузный 1,25; мочевина 0,75, пеногаситель 0,1. Крахмал предварительно гидролизуют амилазой бактериальной. Полученный гидролизат подщелачивают концентрированным раствором едкого натра до значения водородного показателя 7,4 единиц рН, вводят пеногаситель и стерилизуют. После охлаждения до температуры 55°С в эту порцию среды вносят вторую порцию среды, состоящую из кукурузного экстракта, мочевины, калия сернокислого, мела и части пеногасителя. После охлаждения до температуры 43°С среду засевают споровым материалом и режим ферментации осуществляют, как описано в примере 1.

В результате через 17,5 ч процесса получают партии к.ж. с содержанием пектин-лиазы 32050 ед/см³ (на кукурузном крахмале) и 33900 ед/см³ (на картофельном крахмале). Значение водородного показателя в образцах к.ж. составляет соответственно 8,0 и 8,1 единиц рН. Объекты отфильтровывают под вакуумом и в полученные фильтраты вносят по 0,1% хлорида кальция и 9% хлорида натрия. Значение водородного показателя в стандартизованных фильтратах устанавливают концентрированным раствором фосфорной кислоты на уровне 6,8 и 6,9 единиц рН соответственно. Подготовленные фильтраты высушивают на распылительной сушилке в режиме: температура сушильного агента на входе в сушильную камеру (135±5)°С; температура отходящего воздуха (65±5)°С. В результате обезвоживания получают концентраты светло-серого цвета со свойствами:

- из к.ж. на кукурузном крахмале - ПлА 302000 ед/г, СВ 98,3%, термические потери 5,4%;

- из к.ж. на картофельном крахмале - ПлА 314000 ед/г, СВ 98,0%, термические потери 4,7%.

Общий выход препарата по пектин-лиазе от исходного в к.ж. составляет соответственно 76,3 и 77,2%.

Пример 3

Выращивание культуры Bacillus circulans ВКМП-В-5622 проводят в серии испытаний в ферментерах вместимостью 16 дм³ при объеме среды 9 дм³, имеющей следующие составы, %: мука кукурузная до 3,0; отруби пшеничные до 4,0; калий сернокислый 0,2; мел химически осажденный 0,25; экстракт кукурузный 1,25; мочевина 0,75, пеногаситель 0,05. Смесь муки и отрубей предварительно и готовят питательную среду, как описано в примере №1. Затем стерильную среду охлаждают до температуры 41°С и засевают споровым посевным материалом. Режим ферментации осуществляют, как описано в примере №1. В результате через 17-19 ч получают партии к.ж. с содержанием пектин-лиазы от 25800 до 31600 ед/см³ и значением водородного показателя от 8,6 до 8,9 единиц рН. Образцы к.ж. отфильтровывают под вакуумом и в полученные фильтраты вносят по 0,1% хлорида кальция и 8% хлорида натрия. Значение водородного показателя устанавливают концентрированным раствором фосфорной кислоты на уровне от 7,0 до 7,3 единиц рН. Подготовленные фильтраты сушат, как описано в примере №1. В результате обезвоживания получают образцы концентратов светло-серого цвета без явной тенденции к слеживанию, свойства которых представлены в таблице 2.

Таблица 2Свойства партий к.ж., полученной на смеси кукурузной муки и отрубей, и свойства обезвоженных концентратовДозировка углеводного компонента от массы среды, %Свойства
стандартизованного фильтратаСвойства концентратаТермические потери от исходного в к.ж., %мукаотрубиПлА, ед/см³рНПлА, ед/гСВ, % 04,0252007,125600098,77,91,02,0287007,028400097,65,61,51,5299007,227300098,96,42,01,0308007,329500098,34,83,01,0316007,230100098,04,1

Общий выход пектин-лиазы в обезвоженных концентратах составил от исходного в к.ж. от 74,6 до 79,8%.

Пример 4

Культивирование бактерий Bacillus circulans ВКМП-В-5622 осуществляют в ферментере вместимостью 0,5 м³ при объеме питательной среды 0,25 м³. Состав питательной среды, условия ее приготовления и стерилизации, а также режим культивирования те же, что и в примере 1 за исключением дозировки кукурузной муки 2,75% в составе питательной среды. В результате ферментации через 17,5 ч роста получают к.ж. с содержанием пектин-лиазы 27200 ед/см³, СВ 2,9% и значением водородного показателя 8,8 единиц рН. В полученную к.ж. вносят 0,1% хлорида кальция и 9% хлорида натрия. Значение водородного показателя в стабилизированной к.ж. доводят раствором соляной кислоты до 6,7 единиц рН. Подготовленный образец высушивают, как описано в примере №1.

В результате обезвоживания получают концентрат с содержанием пектин-лиазы 257000 ед/г светло-серого цвета. Термические потери при сушке составляют 4,9%. Общий выход в концентрате составляет 89,3% от исходного в к.ж.

Изобретение относится к биотехнологии - глубинному культивированию Bacillus circulans - продуцента фермента пектин-лиазы, жидкостной стандартизации и сушке культуральной жидкости или ее фильтрата. Сущность изобретения заключается в использовании в составе питательной среды исходных компонентов: мука кукурузная (от 2,75 до 3,0%) или крахмал кукурузный (картофельный) (2,75%), или смесь муки кукурузной (до 3%) с отрубями пшеничными (до 4%) - и изменении значения водородного показателя стандартизованных солями фильтрата или культуральной жидкости перед обезвоживанием. Изменение состава питательной среды позволяет достигать более высокой продуктивности процесса биосинтеза пектин-лиазы до 34100 ед/см³ и повышать термоустойчивость фермента до 85,1% от исходного уровня, а изменение режима подготовки объекта к обезвоживанию по значению водородного показателя (от 6,0 до 7,8 единиц рН) обеспечивает дополнительное увеличение термоустойчивости до 12,2%. 2 табл.

Способ получения бактериального ферментного препарата пектин-лиазы, включающий в себя последовательное проведение глубинного культивирования Bacillus circulans, стандартизацию культуральной жидкости или ее фильтратов хлоридом кальция в количестве 0,1% и хлоридом натрия в количестве 5-15% и их сушку, отличающийся тем, что при культивировании используют питательную среду, где в качестве углеводного компонента применяют крахмалосодержащее сырье в количестве 2,75-4,0% и значение водородного показателя объекта обезвоживания устанавливают на уровне 6,0-7,8 единиц рН.