Способ получения ферментного препарата N-ацетил-глюкозаминидазы Советский патент 1981 года по МПК C12D13/10 

велики. Процесс ферментации сравиительно продолжителен.

Цель изобретения - получение нренарата Л-ацетил-глюкозаминндазы с повышенным выходом и его удешевлением.

Цель достигается тем, что в качестве продуцента бактерий из вида Bacillus subtilis используют штамм Bacillus subtilis G-19, при этом культивирование осуществляют в течение 13-15 ч, а в качестве источника углерода и азота используют осахаренный крахмал, кукурузный экстракт и пивные дрожжи.

Штамм характеризуется следующими морфологическими и культурально-физиологическими признаками.

Морфологические признаки. Клетки имеют форму палочек размерами 1,7-3,3 мк на 0,5-0,6 мк. Палочки располагаются цепочками. Палочки подвижные с помощью перетриховых жгутиков, грамцоложительны. Культура образует споры разд1ером 1,0-1,5 мк на 0,7-0,9 мк, форма спор эллипсоидальная, реже цилиндрическая. Прорастают споры экваториально, путем разрыва мембраны вдоль экватора.

Культуральные признаки. На мясо-пептонном агаре после 24-часовой инкубации в термостате культура образует колонии диаметром 2-6 мм. Колонии сероватые, желтоватые, непрозрачные, иногда края гладкие, складчатые в центральной части поверхности.

Иногда культура твердо врастает в агар. На ломтиках картофеля после 48 ч роста образует пленку бело-желтого цвета.

Пленка сморщена и окружена выступами, быстро образует субконечные споры, иногда центральные не деформирующиеся. Пленка сухая в начале роста, становится далее вязкой. На поверхности мясо-псптонного бульона культура образует сморщивающуюся пленку бело-желтоватого цвета, мясо-пептонный бульон остается при этом прозрачным.

Физиологические признаки. Оптимальная температура роста 35-37°С при рН 6,2-6,6. Дыхание строго аэробное. Усваивает глюкозу, сахарозу и фруктозу с образованием кислоты без выделения газа. Не усваивает лактозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, сорбит, маннит, дульцит и инозит. Гидролизует крахмал, разжижает желатину, пептонизирует молоко с образованием сгустка. Растет в среде с цитратами. Нитраты восстанавливает до нитритов. На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол.

Для выращивания бактерий Bacllllus subtilis G-19 готовят питательную среду следующего состава, %: осахаренный крахмал 6,5; кукурузный экстракт 2,7; сухие пивные дрожжи 0,12; двухзамещенный фосфат аммония 0,5; калий сернокислый 0,33;

магний сернокислый 0,016; марганец сернокислый 0,1; кальций хлористый 0,013. Компоненты питательной среды для стерилизации делятся на три группы и стерилизуются раздельно. Питательную среду засеивают посевным материалом Bacillus subtilis G-19, при 45°С и рН - 6,6. В начале ферментации рН снижается до 6,2, после чего автоматически поддерживается рН при подаче 20%-ной аммиачной воды в пределах 6,4-6,6. Продолжительность ферментации 13-15 ч. Активность Л/-ацетил-глюкозаминидазы определяется по вискозиметрическому методу.

Испытание изобретения проведено в лабораторных и полуцроизводственных условиях.

Культивирование проводят глубинным способом в ферментере емкостью 1500 л,

при коэффициенте заполнения 50%, т. е. в 750 л питательной среды. В ферментер передают 100 л осахаренного крахмала с 40-45 Б°; 225 л раствора солей содержащего KsSOi 2,48 «г; MgS04 0,127 кг;

AinSO4 0,75 кг; NaCI 0,248 кг; СаСЬ 0,1 кг. Раствор стерилизуют 30 мин при 130°С.

Для приготовления раствора азотистых веществ в чан заливают 220 л воды и добавляют 20 кг 5iO%-Horo кукурузного экстракта, 0,9 кг сухих пивных дрожжей, 3 л подсолнечного масла. Раствор передают в сателит и стерилизуют 45 мин при 130°С. В другом сателите стерилизуют раствор двухзамещенного фосфата (55 л воды и

3,75 кг (NH4)2HP04) при 130°С в течение 30 мин.

После стерилизации компоненты охлаждают до 45°С и передают в ферментер, доводят рН среды аммиачной водой до 6,6.

После того засеивают посевным материалом Bacillus subtilis G-19, затем включают мешалку и подают стернальный воздух со скоростью 0,4 .

Спустя 4-6 ч температура среды понижается до 37°С и далее поддерживается постоянной во время ферментации рН среды в начале ферментации понижается до 6,2, после чего автоматически поддерживается в пределах 6,4---6,6.

Биосинтез .V-ацетил-глюкозаминидазы начинается с 8 ч ферментации, а особенно интенсивно идет в конце ферментации. Активность Л/-ацетил-глюкозаминидазы в конце ферментации достигает 24 ед/мл.

При производстве ферменгного препарата Л/-ацетил-глюкозаминидазы в объеме 55 т в год в системе Главмикробиопрома годовой экономический эффект составляет 109,5 тыс. руб.

Формула изобретения

Способ получения ферментного препараа //-ацетил-глюкозаминидазы путем кульивирования продуцирующих его бактерий

вида Bacillus subtilis на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента и его удешевления. в качестве продуцента из вида Bacillus subtilis используют штамм Bacillus subtilis G-19, при этом культивирование осуществляют в течение 13-15 час, а в качестве источника углерода и азота используют осахаренный крахмал, кукурузный экстракт и пивные дрожжи.

5Источники информации,

принятые во внимание при экспертизе

1.Tarentino А. L. и Macly F. Journal Biolog chemical, 1974, 249, 3 p. 811-817.

2.Ortiz I. M. и др. «Biochem Biolhyc 10 Asta, 1972, 289 p. 174-186.