Способ количественного определения мебикара в биологических жидкостях Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к исследованин биологических жидкостей. Известен способ количественного определен мебикара в биЬлогическнх жидкостях путем обработки пробы органическим экстрагентом с последующим анализом экстракта методом газо-жидкостной хромотографии 1. Известный способ обладает малой чувствительностью (0,5 мг/мл), недостаточной для оп ределения мебикара в биологических жидкостях человека, высокой трудоемкостью, длител иостью выполнения. Применяемое сложное оборудование недопустимо для большинства клинических лечебных учреждений. Цель нзобретеиия - ускорение и повышение чувствительности способа. Эта, цель достигается тем, что в способе количественного определения мебикара в биол гических жидкостях путем обработки органическим экстрагентом с последующим анализом экстракта методом газо-жидкостиой хроматографии, отличительной особенностью является то, что в качестве экс1рагента используют хлороформ в соотношении 1:15-25, а в качестве хроматографического стандарта - 2,4,5,7, 8,10-гексаметил-2,4,8,10-тетраазобицикло (4,4,0) декандион-3,9. Способ осуществляют следующим образом. Мебикар экстрагируют из образца биологической жидкости 20-кратным обьемом хлороформа 10 мин, разделяют слои, и экстракт упаривают. Сухой остаток растворяют в соответствующем количестве 0,05%-ного хлороформного раствора стандарта, определяемого по табл. 1. Хроматографируют пробу при следующих условиях. Хроматограф газо-жидкостной ЛХМ 8МД, модель 5. Детектор пламенно-ионннэационныи, чувствительность по пропану 5-10. Масштаб регистрации 1/100. Колонка применяется длиной 1 м с внутренним диаметром 3 мм из нержавеющей стали, заполненная 37г 01 17 на хромосорбо 9 (готовая коммерческая фаза фирмы Chemapol (ЧССР). Кондициотрование колонки осуществляется нагреванием до 260° в ре9жиме программирования в течение полутора часов и дальнейшим выдерживанием при этой температуре 8 ч в токе азота. Температур испарителя 250°С. Температура колонки Режим изотермический. Газ-носитель - азот. Скорость на выходе из колонки 30 мл/мин. Вспомогательные газы: воздух - 300 мл/мин, водород - 35 мл/мнн. Растворитель хлоро-. форм. Концентрация растворов 0,05%. Время удерживания мебикара - 1 мин. 50 с. Внутренний стандарт 2,4,7,8,10-гексаметил, 2,4,8,1 тетраазабицикло (4,4,0) декандион-3,9. Время движения ленты самописца - 240 мм/ч. Получение количественных данных. Для нахождения относительных калибровочных коэффициентов мебикара постандартному веществу готовят смеси с точно известным, содержанием мебикара и стандарта в соотношениях 650:500, 500:500 и 350:500 и хроматографируют. В используемом узком диапазоне сигнал детектора является линейным как по определяемому, так и по стандартному вещест ву. Относительная ошибка определения по дан ным ап;1лиза калибровочных смесей составляет 2,4 3,3% ,95). В качестве параметра для расчетов пиков используют высоту (Н). Отсчет производят линейкой с точностью до 0,1 мм. В табл. 1 приведено количество iO,05% хлороформного раствора ставдарта, необходимое для растворения сухого остатка. Содержание мебикара в пробе для хромато графирования не зависимо от исходной концен трации мебикара в биожидкости равно содержанию ставдарта и одной и той же величине. Добавляя стандарт таким образом нет необходимости в корректировке количества вводимо пробы и масштаба регистрации детектора. Исключается влияние искажений, связанных с нелинейностью сигнала детектора по определяе мому и стандартному веществам, отсутствует необходимость в периодической проверке калибровочных коэффициентов в щирвком диапазоне. Чувствительность анализа составляет 10 8 г. Возможные примеси, содержащиеся в хлоро формных экстрактах, не влияют на форму пи ков и времена удерживания хроматографируемых веществ. Пример 1. Количественное определение мебикара в моче человека (искусственные смеси). Готовят точные растворы мебикара в моче в концентрациях, указанных в табл. 2. Дезактивируют ферменты нагреванием на . кипящей водяной базе 5 мин 2 мл приготовленной искусственной смеси помещают в цилшщр на 60 мл с притертой пробкой, закрепляют на шейкере в наклонном положении и экстрагируют 10 мин. Водный слой удаляют 4 тсасыванием. Хлороформную фракцию отгоняют на роторном испарителе под вакуумом водоструйиого насоса приблизительно до обьема в 2 мл и фильтруют экстракт через воронку со стеклотканью в микрофлакон на 5 мл. Дополнительно омывают стенки 1илиндров 2 мл хлороформа и добавляют их через фильтр к экстракту. Экстракт упаривают досуха в токе азота. Сухой остаток растворяют в 0,5%-ном хлороформном растворе стандарта, как указано в табл. 1. 1 мкл полученного раствора вводят микрошприцом в испаритель хроматографа. Измеряют отношения высот пиков мебикара и.стандарта. Содержание мебикара вычисляют по формуле А ХКЮО, где А - содержание мебикари в мкг; X - коэффициент, кратный опрс;1слясм 1М концентрациям мебикара: К - относительный к;1,1ибровочный коэффиВ табл. 2 приведены результаты ортределекия мебикара в моче (искусственные смеси). Пример 2. Количественное определение мебикара в плазме крови человека (искусственные смеси). Получают плазму из крови донора, содержащей 5% (по обьему) 10%-ного раствора цитрата натрия, центрифугированием 10 мин при 3000 об/мин. Готовят точные растворы мебикара в плазме крови в концентрациях, указанных в табл. 3. 2 мл приготовленной искусственной смеси помещают в цилиндр на 60 мл с притертой пробкой и далее поступают, как описано в приме|5е 1. Результаты определений приведены в табл. 3. Пример 3. Количественное определение мебикара в моче человека (больной Катасоиов Ю. А., 43 года). Отбирают образцы мочи до приема мебикара (контроль) и в течение трех суток после приема разовой дозы 0,6 г (перорально). Дезактивируют ферменты нагреванием на кипящей водяной бане 5 мин 2 мл каждого образца помещают в цилиндр с притертой пробкой и далее поступают, как описано в примере I. Для коррекции количества, стандарта, необходимого .для растворения сухого остатка, проводят по 2 параллельных определения каждого образца мочи. Результаты определений мебикара в моче больного приведены в табл. 4. Данные в табл. 4 показывают, что предлагаемый способ позволяет определять содержание мебикара в моче человека, начиная с момента введения и кончая элиминацией из организма. При лабораторных испытаниях предлагаемого способа выявлены следующие преимущества по сравнению с известным способом: чувстви59тельность определения повышается в раз; извлечение мебикара иэ жидкостей выше в среднем повышается на 5-10%; время анализа сокращается в два раза; вместо хлористого метилена используется менее токсичный хлороформ; анализ упрощается благодаря применению доступного метода газовой хроматографии вместо протонной магнитной резоиансной спектроскопии. Использование предлагаемого способа определения мебикара в биологических жидкостях по сравнению с известным способом обеспечивает возможность определения мебикара в биологических жидкостях с высокой воспроизводимостью полученных данных, что важно для изучения фармакокинетики мебикара и позволяет уменьшить время, затрачиваемое на аналнз, использовать достутпюе оборудование. Таблица 1

994357110

Формула изобретения8ё этсстрагента используют хлороформ в cootСпособ количественного определения мебика- ческого стандарта - 2,4,5,7,8,10-гексамет|1Лра в биологических жидкостях, путем обра-2..8.10-тетрааэобицикло(4,4,0)декандион-3,9.

боткн пробы органическим жстрагентом с по- $Источники ннформащш,

следующим анализом экстракта методом газо-принятые во внимание при экспертизе

жидцсостной хроматографии, отличаю-1- Бочкарева О. М. Химико-фармацевтичесщ и и с я тем, что, с целью ускорения икое изучение нового транквилизатора мебикаповышения чувствительности способа, в качест- ра.

вошешш 1:15-25, а в качестве хроматографи